Vurdering af cellulære immunrespons i frugtflue Drosophila melanogaster, ved hjælp af en i Vivo fagocytose Assay

Summary

Denne protokol beskriver en in vivo fagocytose assay i voksen Drosophila melanogaster at kvantificere phagocyt anerkendelse og clearance af mikrobielle infektioner.

Abstract

I alle dyr giver medfødt immunitet en øjeblikkelig og robuste forsvar mod et bredt spektrum af patogener. Humorale og cellulære immunrespons er de vigtigste grene af medfødt immunitet, og mange af de faktorer, der regulerer disse svar er evolutionært bevaret mellem hvirvelløse dyr og pattedyr. Fagocytose, den centrale del af cellulære medfødt immunitet, udføres af specialiserede celler i immunsystemet. Bananfluen Drosophila melanogaster, fremstod som en kraftfuld genetiske model til at undersøge de molekylære mekanismer og fysiologiske virkninger af fagocytose i hele dyr. Her viser vi en injektion-baserede in vivo fagocytose assay for at kvantificere partikel optagelse og ødelæggelse af Drosophila blodlegemer, hemocytes. Proceduren, der giver forskere til netop kontrol partikel koncentration og dosis, hvilket gør det muligt at opnå meget reproducerbare resultater i en kort tid. Eksperimentet er kvantitative, nem at udføre og kan anvendes til at screene for værten faktorer at indflydelse patogen anerkendelse, optagelse og clearance.

Introduction

Medfødte immun forsvaret danne den første linje i forsvaret mod patogene mikrober. Disse svar kan opdeles funktionelt humorale og cellulære medfødt immunitet, som begge er medieret af germline-kodet mønster anerkendelse receptorer (PRRs) at fornemmer patogen-associeret molekylære mønstre (PAMPs)¹. Mange af de signaling veje og effektor mekanismer af medfødt immunitet er bevaret i pattedyr og hvirvelløse dyr, såsom fyrretræsnematoden, Caenorhabditis elegans, og bananfluen Drosophila melanogaster². Frugt fly fremstod som et kraftfuldt system at studere vært forsvar mod smitsomme mikroorganismer³. Drosophila er genetisk tractable, nemt og billigt opdrættet i laboratorier, og har en kort generationstid. Derudover udstiller frugtflue højeffektive forsvar mod en bred vifte af mikrober, gør det muligt for undersøgelse af vært immunitet mod viral, bakterie, svampe eller parasitære patogener.

Drosophila immunologists har historisk udnyttet fremad genetiske skærme, genome-wide RNA-medieret interferens (RNAi) screening af insekt cellelinjer, og præ-eksisterende flyve mutantstammen for at undersøge medfødt immunitet – fører til den identifikation og karakterisering af flere evolutionært bevarede humorale immun veje^4,5,6,7,8. Den humorale medfødte immun respons er velsagtens, bedst karakteriseret immunforsvaret i bananfluer. Efter infektion fører den humorale respons til produktion og systemisk frigivelse af antimikrobielle peptid (AMP) molekyler til hemolymph, blodet svarer i insekter. Ampere er produceret af stærkt bevarede vejafgift og Imd signalering veje. Vejafgift vej er homologe til pattedyr TLR/IL-1R receptor signalering, og Imd pathway er homologe til pattedyr Tumor nekrose faktor-alfa signalering. I Drosophila, vejafgift signalering er foranlediget af gram-positive bakterier, svampe og Drosophila X virus^6,9,10 og Imd signalering er foranlediget af gram-negative bakterier^{11 ,12}.

Cellulær immunitet, består af indkapsling, melanization og fagocytose af invasive patogener, udført af specialiserede celler kaldes hemocytes¹³. Der er tre klasser af hemocytes i bananfluen: krystal celler, lamellocytes og plasmatocytes¹³. Krystal celler, som udgør 5% af de cirkulerende hemocytes i larver, frigive proPhenoloxidase (proPO) enzymer fører til melanization af patogener og værten væv på sår websteder. Lamellocytes, som ikke normalt findes i sund embryoner eller larver, er vedhængende celler, der indkapsler fremmedlegemer. Disse celler er induceret ved pupariation, eller når parasitizing hveps Rognene bliver lagt i larver. Fagocyterende plasmatocytes, som udgør 95% af det cirkulerende hemocytes i larver og alle resterende hemocytes i voksne, spille en rolle i væv remodellering under udvikling, og navnlig, tjene som den vigtigste effektor celle i Drosophila cellulær immunitet.

Fagocytose en umiddelbar og afgørende linje i medfødte immun forsvaret; mikrober, der bryder den vært epitel barriere er hurtigt opslugt og elimineret af fagocyterende celler (For en omfattende gennemgang af cellebiologi af fagocytose Se reference ¹⁴). Denne proces sættes i gang når germline-kodet mønstergenkendelse receptorer (PRRs) på hemocytes genkende patogen associeret molekylære mønstre (PAMPs) af mikrober. En gang bundet til deres mål, indlede PRRs signaling cascades, der fører til dannelsen af pseudopods gennem actin cytoskeleton remodellering. Pseudopods surround mikrobe, som efterfølgende er opslugt og internaliseret i en spirende organelle, phagosome. Mikrober er ødelagt som phagosome gennemgår processen med phagosome modning når phagosome er smugles mod hemocyte indre og forsurer gennem en serie af interaktioner med lysosomer. I vitro og celle har biologi undersøgelser i pattedyrceller primære været medvirkende til at identificere og karakterisere faktorer, der regulerer fagocytose, som pattedyr Fc-gamma receptor og C3b receptorer^15,16. Ikke desto mindre, evnen til at udføre store skærme eller in vivo-undersøgelser er begrænset i pattedyr systemer.

Her præsenterer vi en in vivo assay for fagocytose i voksen bananfluer, som er baseret på en af David Schneider laboratorium i 2000¹⁷først indførte procedure. Schneider lab viste, at siddende hemocytes grupperet langs den abdominale dorsale fartøj let phagocytosis polystyren perler og bakterier. For at visualisere fagocytose, fluer er indsprøjtet med fluorescently mærket partikler (såsom E. coli mærket med fluorescein isothiocyanat (E. coli –FITC)), inkuberes i 30 minutter for at tillade hemocytes tid til at opsluge partiklerne, og derefter injiceres med trypan blå, som slukker fluorescens af partikler ikke phagocytosed under inkubationstiden. Flyve dorsale fartøjer er derefter afbildet ved hjælp af en omvendt fluorescerende mikroskop. Denne skelsættende papir, ved hjælp af et relativt simpelt eksperiment, viste, at hemocytes phagocytosis bakterier og latex perler, at bakteriel fagocytose kan hæmmes ved indblæsning af pre flyver med latex perler, og der flyver uden cellulære og humorale immunrespons er modtagelige selv for E. coli. Analysen i denne rapport bygger på arbejdet i Schneider lab at kvantificere in vivo fagocytose af måling af fluorescens-intensiteten af partikler opslugt af dorsale fartøj forbundet hemocytes.

Svarer til holdningen i pattedyr systemer, Drosophila genetikere starten brugte genome-wide in vitro-RNAi skærme for at identificere gener, der kræves til den cellulære immunrespons^{18,19,20 ,21,22,23}. Men udviklingen af adult in vivo fagocytose assay aktiveret opfølgende forsøg skal udføres let i hele dyr, således at forskere til at kontrollere biologiske rolle i in vitro undersøgelser faktorer. Sådan var tilfældet med den transmembrane receptor Eater, som blev først identificeret som en bakteriel receptor i et RNAi skærmen ved hjælp af S2 celler²⁴ og derefter senere vist at mægle Escherichia coli (E. coli), Enterococcus faecalis, og Staphylococcus aureus (S. aureus) fagocytose i voksne²⁵.

Vores lab ansat in vivo fagocytose assay i fremad genetiske skærme og genome-wide association studier (ved hjælp af Drosophila genetiske Reference Panel (DGRP)) til at identificere nye gener, der regulerer fagocytose i voksen hemocytes. Disse undersøgelser førte til karakterisering PGRP-SC1A-receptorer og PGRP-SA²⁶, den intracellulære vesikel Handel protein Rab14²⁷, glutamat transporter Polyfem²⁸og RNA-bindende protein Fox-1²⁹.

Vi forventer, at fremtidige skærme indarbejde den in vivo fagocytose kunne føre til identifikation af yderligere gener, der er vigtig for cellulære immunrespons i Drosophila. Skærme bruger fuldt sekventeret indavlede linjer, som DGRP eller Drosophila syntetiske befolkning ressource (DSPR), kan identificere naturlige varianter påvirker fagocytose eller hemocyte udvikling. Desuden kunne teknikken vedtages i andre arter af Drosophila eller anvendes til skærmen nye fællesskabsmidler såsom indsamling af 250 Drosophila arter vedligeholdes af de nationale Drosophila arter Stock Center (NDSSC ) på Cornell. Disse forsøg kan foretages ved hjælp af fluorescently mærket bakteriel eller svampeinfektion-væg bioparticles der findes i handelen og kan udføres ved hjælp af et vilkårligt antal af bakterie- eller svampeinfektion arter – forudsat at mikrobe udtrykker fluorescerende markører .

Protocol

1. Forbered Fluorescein partikler til injektion Rekonstruere 10 mg af kommercielt tilgængelige, Varme-dræbte bakterier partikler mærket med fluorescein (Se Tabel af materialer) til en stock koncentration på 10 mg/mL ved at tilføje 990 µL sterilt 1 x PBS og 10 µL 50 mM natriumazid. Vortex at blande. Opdele i engangsbrug 8 µL delprøver i 0,2 mL rør og gemme i en mørk kasse ved 4 ° C at minimere tilknyttede lysfølsomhed.Bemærk: Natriumazid konserverende er valgfri og kan …

Representative Results

En skematisk af in vivo fagocytose analysen ved hjælp af fluorescein-mærket partikler er vist i figur 1A. Fluer er monteret ventrale side ned på et stykke af elektrisk tape og de første to segmenter af maven, hvor den dorsale fartøj er placeret, er klart synlige (figur 1B). Vigtige kilder til eksperimentel fejl opstår på injektion og imaging trin af proceduren (figur 1 c). Ved hjælp af den sa…

Discussion

Kommercielt tilgængelige, fluorescently mærket partikler bruges til at vurdere fagocytose i almindelighed (0,2 µm carboxylat modificerede mikrokugler) eller fagocytose af mikrober (fluorescently mærket varme – eller kemisk dræbte bakterier eller gær). For at vurdere phagosome modning, kan forskere vælge partikler mærket med en pH-følsom farvestof, der fluorescerer når pH falder fra neutral til Sure, som i phagolysosome. Alternativt, for at undersøge de indledende trin i fagocytose, patogen anerken…

Materials

0.2μm Red Fluorescent Carboxylate Modified FluoSpheres	Invitrogen	F8810	Fluorescently-labeled latex beads to test general phagocytic capacity of phagocytes. (~580/~605 nm) Inject a 1:20 dilution in PBS with 5% dye.
5430-10 PicoNozzle Kit	World Precision Instruments	5430-10	Holder for 1.0mm pipette
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate	Invitrogen	E13231	Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~495/~519 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate	Invitrogen	E23370	Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~590/~617 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Fluorescein conjugate	Invitrogen	E2861	Killed E. coli labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~494/~518 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate	Invitrogen	E2863	Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate	Invitrogen	E2863	Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm)
Needle Pipette Puller	David Kopf Instruments	Model 725
pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate for Phagocytosis	Invitrogen	P35361	Killed E. coli labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-negative bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue.
pHrodo Red S. aureus BioParticles Conjugate for Phagocytosis	Invitrogen	A10010	Killed S. aureus labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-positve bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue.
Pneumatic PicoPump PV820	World Precision Instruments	SYS-PV820	The World Precision Instruments Pneumatic PicoPump PV820 uses differential pressures to hold liquid in the glass needle between injections. The user manually controls short bursts of gas pressure to expel the liquid – allowing delivery of sub-nanoliter volumes. The amount of liquid delivered depends on two main variables – the size of the glass needle opening and the amount of time injection pressure is applied. set the instrument to 100 ms “TIMED” mode.
S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate	Invitrogen	S23371	Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~495/~519 nm)
S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate	Invitrogen	S23372	Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~590/~617 nm)
S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Fluorescein conjugate	Invitrogen	E2851	Killed S. aureus labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~494/~518 nm)
Thin Wall Glass Capillaries	World Precision Instruments	TW100F-3	Needles for injection. OD = 1.0 mm
Trypan Blue Solution (0.4%)	Sigma	T8154	Used to quench extracellular fluorescence of Fluorescein, Alexa Fluor, or Texas Red labeled particles.
ZEISS SteREO Microscope (Discovery.V8)	Zeiss	SteREO Discovery.V8	Inverted fluorescence microscope for imaging flies. Use a digital camera (example: AxioCam HC camera) and the accompanying software (example: AxioVision 4.7 software) to take pictures.
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate	Invitrogen	Z23373	Killed labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~495/~519 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate	Invitrogen	Z23374	Killed labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~590/~617 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Fluorescein conjugate	Invitrogen	Z2841	Killed labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~494/~518 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Texas Red	Invitrogen	Z2843	Killed labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~595/~615 nm)