Beurteilung der zellulären Immunantwort der Fruchtfliege Drosophila Melanogaster, mit einem In-Vivo-Phagozytose-Assay

Summary

Dieses Protokoll beschreibt einen in-vivo Phagozytose Assay in Erwachsenen Drosophila Melanogaster , Phagozyten Anerkennung und Räumung von mikrobiellen Infektionen zu quantifizieren.

Abstract

Bei allen Tieren bietet die angeborene Immunität eine sofortige und robuste Verteidigung gegen ein breites Spektrum von Krankheitserregern. Humorale und zelluläre Immunantwort sind die Hauptzweige der angeborenen Immunität, und viele der Faktoren, die zur Regelung dieser Reaktionen sind evolutionär konserviert zwischen Wirbellosen und Säugetiere. Phagozytose, die zentraler Bestandteil der zellulären angeborenen Immunität erfolgt durch spezialisierte Zellen des Immunsystems. Die Fruchtfliege Drosophila Melanogaster, entstanden als ein leistungsfähiges genetisches Modell, die molekularen Mechanismen und physiologischen Auswirkungen der Phagozytose in ganze Tiere zu untersuchen. Hier zeigen wir einen Injektion-basierte in-vivo Phagozytose Assay um die Partikel Aufnahme und Zerstörung von Blutkörperchen Drosophila , Hemocytes zu quantifizieren. Das Verfahren ermöglicht Forschern genau steuern die Partikelkonzentration und Dosis, macht es möglich, hoch reproduzierbare Ergebnisse in kürzester Zeit zu erhalten. Das Experiment ist quantitativ, einfach durchzuführen, und Bildschirm für Host Faktoren dieser Einfluss Erreger Anerkennung, Aufnahme und Abstand angewendet werden können.

Introduction

Angeborenen Immunabwehr bilden die erste Verteidigungslinie gegen pathogene Keime. Diese Reaktionen können funktionell humorale und zelluläre angeborene Immunität unterteilt werden, die beide durch Keimbahn-kodierte Muster Anerkennung Rezeptoren (PRRs), die Pathogen-assoziierte molekulare Muster (PAMPs)¹Sinn vermittelt werden. Ein Großteil der Signalwege und Effektor Mechanismen der angeborenen Immunität sind bei Säugetieren und Wirbellose Tiere, wie z. B. der Fadenwurm Caenorhabditis Elegans und der Fruchtfliege Drosophila Melanogaster²konserviert. Die Fruchtfliege ist ein leistungsfähiges System Host Verteidigung gegen infektiöse Mikroorganismen³studieren entstanden. Drosophila ist genetisch gefügig, einfach und kostengünstig in Laboratorien, aufgezogen und hat eine kurze Generationszeit. Darüber hinaus weist der Fruchtfliege hoch effiziente Abwehr gegen ein Array von Mikroben, die Prüfung der Host Immunität gegen virale, bakterielle, Pilze oder parasitäre Erreger aktivieren.

Drosophila Immunologen haben historisch verwendet vorwärts genetischer Bildschirme, genomweiten RNA-vermittelte Interferenz (RNAi screening von Insekten Zelllinien und bereits vorhandene mutierte Fliege Stämme um angeborene Immunität – führt zu untersuchen) die Identifizierung und Charakterisierung der mehrere evolutionär konservierte humorale Immunsystem Wege^4,5,6,7,8. Die angeborene humorale Immunantwort ist wohl, das beste gekennzeichnet Immunabwehr bei Fruchtfliegen. Nach Infektion führt die humorale Antwort zu die Produktion und die systemische Freisetzung von antimikrobiellen Peptid (AMP) Moleküle in die Hämolymphe, das Blut gleichwertig in Insekten. Verstärker sind von hoch konservierte Maut und Imd Signalwege produziert. Der Maut-Pfad ist homolog zu Säugetieren TLR/IL-1R-Rezeptor Signalgebung und der Imd-Pfad ist homolog zu Säugetieren Tumor-Nekrose-Faktor-Alpha-Signalisierung. In Drosophila, Maut Signalisierung wird induziert durch Gram-positiven Bakterien, Pilze und Drosophila X Virus^6,9,10 und Imd Signalisierung wird induziert durch gramnegative Bakterien^{11 ,12}.

Zelluläre Immunität, bestehend aus Kapselung, Melanization und Phagozytose invasive Erreger durch spezialisierte Blutkörperchen genannt Hemocytes¹³durchgeführt. Es gibt drei Klassen von Hemocytes in der Taufliege: Kristall Zellen, Lamellocytes und Plasmatocytes¹³. Kristall-Zellen, die machen 5 % der zirkulierenden Hemocytes in Larven frei ProPhenoloxidase (d) Enzyme führt zu Melanization Erreger und Wirt Gewebe an Wunde Stellen. Lamellocytes, die normalerweise nicht in gesunden Embryonen oder Larven gefunden werden, sind adhärente Zellen, die Fremdkörper zu Kapseln. Diese Zellen induziert werden, beim Pupariation oder beim Fliegen Wespe Eier in die Larven hinterlegt sind. Phagocytic Plasmatocytes, die 95 % der zirkulierenden Hemocytes bei Larven und alle restlichen Hemocytes bei Erwachsenen ausmachen, spielen eine Rolle im Gewebe Umbau während der Entwicklung und vor allem dienen als die wichtigsten Effektor-Zelle von Drosophila zelluläre Immunität.

Phagozytose eine unmittelbare und entscheidende Linie der angeborenen Immunabwehr; Mikroben, die die Host epitheliale Barriere zu durchbrechen sind schnell verschlungen und eliminiert durch phagocytic Blutzellen (für eine umfassende Überprüfung der Zellbiologie der Phagozytose siehe Referenz ¹⁴). Dieser Prozess wird eingeleitet, wenn Keimbahn-codierte Mustererkennung Rezeptoren (PRRs) auf Hemocytes Erreger erkennen molekulare Muster (PAMPs) von Mikroben verbunden. Nach der Bindung an ihre Ziele, initiieren PRRs Signalisierung Kaskaden, die zur Bildung von Scheinfüßchen durch Aktin Zytoskelett Umgestaltung führen. Die Scheinfüßchen umgeben die Mikrobe, die anschließend verschlungen und in einer im Entstehen begriffenen Organell, das Phagosom verinnerlicht. Mikroben sind zerstört, als die Phagosom das Phagosom Reifung durchläuft wenn das Phagosom Opfer von in Richtung des Inneren der Hemocyte Menschenhandel ist und durch eine Reihe von Wechselwirkungen mit Lysosomen säuert. In Vitro und Zelle haben Studium der Biologie in Säugetierzellen Primary maßgeblich bei der Identifizierung und Charakterisierung von Faktoren, die Phagozytose, wie Säugetier-Fc-Gamma-Rezeptor und C3b Rezeptoren^15,16zu regulieren. Dennoch sind die Fähigkeit zum Ausführen von großen Bildschirmen oder in vivo Studien in Säugetier-Systeme beschränkt.

Hier präsentieren wir Ihnen einen in-vivo Assay für Phagozytose bei Erwachsenen Fruchtfliegen, basiert auf einem Verfahren erstmals im Labor von David Schneider in 2000¹⁷. Das Schneider-Labor zeigte, dass festsitzende Hemocytes gruppierten entlang der Abdominal-dorsalen Gefäß leicht Polystyrol-Kügelchen und Bakterien phagozytieren. Um Phagozytose zu visualisieren, fliegen mit Gewebekulturen beschrifteten Partikel (z. B. E. Coli mit Fluorescein erfolgt (E. Coli –FITC) gekennzeichnet), injiziert sind für 30 Minuten zu Hemocytes Zeit, um die Partikel zu verschlingen inkubiert und dann mit Trypan blau, die die Fluoreszenz der Partikel nicht phagozytiertes während der Inkubationszeit stillt injiziert. Fliegen dorsalen Gefäße werden dann abgebildet mit einem inversen Fluoreszenz-Mikroskop. Diese Samen-Papier mit ein relativ einfaches Experiment nachgewiesen, dass Hemocytes Bakterien phagozytieren und Latex Perlen, dass bakterielle Phagozytose durch die Injektion von Pre gehemmt werden können mit Latex Perlen fliegt und fliegt ohne zelluläre und humorale Immunantworten sind auch anfällig für E. Coli. Der Test in diesem Bericht vorgestellten baut auf der Arbeit von Schneider-Lab, in-vivo Phagozytose durch Messung der Fluoreszenzintensität von Partikeln durch dorsale Schiff verbundenen Hemocytes verschlungen zu quantifizieren.

Ähnlich wie bei dem Ansatz Säugetier-Systeme, Drosophila Genetiker ursprünglich verwendet genomweite in-vitro-RNAi-Bildschirme um zu identifizieren, die für die zelluläre Immunantwort^{18,19,20 erforderlich ,21,22,23}. Jedoch ermöglichte die Entwicklung des Erwachsenen in-vivo Phagozytose Assays Follow-up-Experimente bereitwillig in ganze Tiere, so dass Forscher die biologischen überprüfen die Rolle der Faktoren, die in in-vitro-Studien durchgeführt werden. Dies war der Fall mit dem transmembrane Rezeptor Esser, die zunächst als ein bakterielle Rezeptor in einer RNAi-Bildschirm mit S2²⁴ Zellen identifiziert und dann später gezeigt, um Escherichia coli (E. Coli),, Enterococcus vermitteln Faecalis, und Staphylococcus Aureus (S. Aureus) Phagozytose in Erwachsene²⁵.

Unser Labor beschäftigt die in-vivo Phagozytose Assay in vorwärts genetischer Bildschirme und genomweite Assoziationsstudien (unter Verwendung der Drosophila genetische Referenz Panel (DGRP)), um neuartige Gene zu identifizieren, die Phagozytose in Erwachsenen Hemocytes zu regulieren. Diese Studien führten bis hin zur Charakterisierung der Rezeptoren PGRP-SC1A und PGRP-SA²⁶, die intrazelluläre Vesikel Handel Protein Rab14²⁷, die Glutamat-Transporter Polyphem²⁸und RNA-bindende Protein Fox-1²⁹.

Wir gehen davon aus, dass zukünftige Bildschirme unter Einbeziehung der in-vivo Phagozytose zur Identifizierung von zusätzlichen Gene führen könnte, die wichtig für die zelluläre Immunantwort bei Drosophilasind. Bildschirme mit vollständig sequenziert Inzuchtlinien, z. B. die DGRP oder die Drosophila synthetische Bevölkerung Ressource (DSPR), können natürliche Varianten die Phagozytose oder Hemocyte Entwicklung zu identifizieren. Darüber hinaus könnte die Technik angenommen in andere Arten von Drosophila oder verwendet, um Bildschirm neue Community-Ressourcen, wie z. B. die Sammlung von 250 Drosophila -Arten gepflegt durch die nationalen Drosophila Arten Lager Center (NDSSC ) an der Cornell University. Diese Experimente durchgeführt werden können mit Gewebekulturen beschriftet bakterielle oder Pilzinfektionen-Wand Bioparticles, die im Handel erhältlich sind oder können mit einer beliebigen Anzahl von bakterielle oder Pilzinfektionen Arten – vorausgesetzt, dass die Mikrobe fluoreszierenden Marker drückt durchgeführt werden .

Protocol

1. bereiten Sie Fluorescein Partikel zur Injektion 10 mg im Handel erhältlichen, Hitze getötet Bakterien rekonstruieren Partikel mit Fluorescein gekennzeichnet (siehe Tabelle der Materialien) Lager Konzentration von 10 mg/mL durch Zugabe von 990 µL steriler 1 X PBS und 10 µL 50 mM Natriumazid. Vortex mischen. In Einweg-8 µL-Aliquots in 0,2 mL Röhrchen teilen und speichern in einer dunklen Box bei 4 ° C, Lichtempfindlichkeit verbunden zu minimieren.Hinweis: Konservierungsmitte…

Representative Results

Abbildung 1Azeigt eine schematische Darstellung des in-vivo Phagozytose Assays mit Fluorescein-markierten Partikeln. Fliegen sind berittene Bauchseite nach unten auf ein Stück Isolierband und die ersten beiden Segmente des Abdomens, wo der dorsale Gefäß befindet, ist deutlich sichtbar (Abb. 1 b). Hauptquellen der experimentellen Fehler entstehen bei der Injektion und imaging-Schritte des Verfahrens (Abbild…

Discussion

Handelsübliche, Eindringmittel beschrifteten Partikel werden zur Phagozytose im Allgemeinen (0,2 µm Carboxylat-modifizierte Mikrosphären) oder Phagozytose von Mikroben (Eindringmittel beschriftet Hitze- oder chemisch tote Bakterien oder Hefe) zu beurteilen. Um Phagosom Reifung zu beurteilen, können Forscher wählen Sie Partikel beschriftet mit einem pH-Sensitive-Farbstoff, der fluoresziert, wenn der pH-Wert von neutral zu sauer, wie in der Phagolysosome abnimmt. Alternativ um die ersten Schritte der Phag…

Materials

0.2μm Red Fluorescent Carboxylate Modified FluoSpheres	Invitrogen	F8810	Fluorescently-labeled latex beads to test general phagocytic capacity of phagocytes. (~580/~605 nm) Inject a 1:20 dilution in PBS with 5% dye.
5430-10 PicoNozzle Kit	World Precision Instruments	5430-10	Holder for 1.0mm pipette
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate	Invitrogen	E13231	Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~495/~519 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate	Invitrogen	E23370	Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~590/~617 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Fluorescein conjugate	Invitrogen	E2861	Killed E. coli labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~494/~518 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate	Invitrogen	E2863	Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate	Invitrogen	E2863	Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm)
Needle Pipette Puller	David Kopf Instruments	Model 725
pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate for Phagocytosis	Invitrogen	P35361	Killed E. coli labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-negative bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue.
pHrodo Red S. aureus BioParticles Conjugate for Phagocytosis	Invitrogen	A10010	Killed S. aureus labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-positve bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue.
Pneumatic PicoPump PV820	World Precision Instruments	SYS-PV820	The World Precision Instruments Pneumatic PicoPump PV820 uses differential pressures to hold liquid in the glass needle between injections. The user manually controls short bursts of gas pressure to expel the liquid – allowing delivery of sub-nanoliter volumes. The amount of liquid delivered depends on two main variables – the size of the glass needle opening and the amount of time injection pressure is applied. set the instrument to 100 ms “TIMED” mode.
S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate	Invitrogen	S23371	Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~495/~519 nm)
S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate	Invitrogen	S23372	Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~590/~617 nm)
S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Fluorescein conjugate	Invitrogen	E2851	Killed S. aureus labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~494/~518 nm)
Thin Wall Glass Capillaries	World Precision Instruments	TW100F-3	Needles for injection. OD = 1.0 mm
Trypan Blue Solution (0.4%)	Sigma	T8154	Used to quench extracellular fluorescence of Fluorescein, Alexa Fluor, or Texas Red labeled particles.
ZEISS SteREO Microscope (Discovery.V8)	Zeiss	SteREO Discovery.V8	Inverted fluorescence microscope for imaging flies. Use a digital camera (example: AxioCam HC camera) and the accompanying software (example: AxioVision 4.7 software) to take pictures.
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate	Invitrogen	Z23373	Killed labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~495/~519 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate	Invitrogen	Z23374	Killed labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~590/~617 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Fluorescein conjugate	Invitrogen	Z2841	Killed labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~494/~518 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Texas Red	Invitrogen	Z2843	Killed labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~595/~615 nm)