과일 파리, 초파리 melanogaster에 비보 먹어서 분석 결과 사용 하 여의 세포 면역 반응 평가

Summary

이 프로토콜에서는 성인 초파리 melanogaster 식 인식 및 미생물 감염의 계량에서 vivo에서 먹어서 분석 결과를 설명 합니다.

Abstract

모든 동물에서 타고 난 면제는 광범위 한 병원 균에 대 한 즉각적이 고 강력한 방어를 제공합니다. 체액과 세포 면역 응답은 타고 난 면제의 주요 지점 그리고 이러한 응답을 조절 하는 요인의 많은 무척 추 동물과 포유류 사이 보존 진화론은. 식 균 작용, 세포 타고 난 면제의 중심 구성 요소 특수 혈액 세포의 면역 시스템에 의해 수행 됩니다. 과일 파리, 초파리 melanogaster, 분자 메커니즘 먹어서 전체 동물에서의 생리 적 영향을 조사 하는 강력한 유전자 모델로 떠오르고 있다. 여기 우리 초파리 혈액 세포, hemocytes에 의해 입자 통풍 관 그리고 파괴를 계량을 vivo에서 먹어서 주입 기반 분석 결과를 보여 줍니다. 절차 수 연구원은 정확 하 게 제어할 입자 농도 복용량, 시간의 짧은 시간에 높은 재현성 결과 얻을 수 있습니다. 실험은 양적, 수행, 쉽게 그 영향 병원 체 인식, 이해, 및 허가 호스트 요소에 대 한 화면에 적용할 수 있습니다.

Introduction

타고 난 면역 방어는 병원 성 미생물에 대 한 방어의 첫 번째 줄을 형성 한다. 이러한 응답 기능 둘 다 생식 인코딩 패턴 인식 수용 체 (호흡기) 병원 체 관련 된 분자 패턴 (PAMPs)¹감각에 의해 중재는 체액과 세포 타고 난 면역으로 나눌 수 있습니다. 신호 통로의 많은 및 타고 난 면제의 effector 메커니즘 포유류에는 선 충 류, 꼬마 선 충, 과일 파리, 초파리 melanogaster²같은 무척 추 동물 보존 됩니다. 과일 파리 감염 미생물³에 대 한 호스트 방어를 공부 하는 강력한 시스템으로 떠오르고 있다. 초파리 유전자 온순한 쉽고 저렴 하 게 실험실에 reared 이며 짧은 생성 시간을 보내고 있다. 또한, 과일 파리는 다양 한 세균, 바이러스, 세균, 곰 팡이, 또는 기생 하는 병원 체에 대 한 호스트의 시험 사용에 대 한 매우 효율적인 방어를 전시 한다.

초파리 immunologists 앞으로 유전 스크린, 게놈 넓은 중재 하는 RNA 간섭 (RNAi) 곤충 세포 라인의 검사 및 검사에 지도 하는 타고 난 면제-돌연변이 비행 긴장 기존 활용 역사적으로 식별 및 여러 진화론 보존된 체액 면역 경로^4,5,6,,78의 특성 체액의 타고 난 면역 반응, 틀림 없이, 최고의 특징 과일 파리에 면역성이 있는 방위. 감염, 다음 체액 반응 리드 생산 및 항균 펩타이드의 조직 릴리스 (AMP) 분자 hemolymph, 곤충에 해당 혈액으로. 앰프는 매우 보존된 수신자와 Imd 신호 통로 의해 생산 됩니다. 수신자 통로 포유 동물에 동종 TLR/IL-1R 수용 체 신호 전달, 그리고 Imd 통로 포유류 종양 괴 사 인자-알파 신호 동종. 초파리, 통행세에 있는 그람 양성 박테리아, 곰 팡이, 그리고 초파리 X 루의^6,,910 에 의해 유도 된다 신호 및 그램 음성 박테리아^{11에 의해 유도 된다 Imd 신호 ,12}.

캡슐화, melanization, 및 침략 병원 균의 식 균 작용의 구성 세포 면역, hemocytes¹³라는 특수 혈액 세포에 의해 수행. 과일 파리에서 hemocytes의 3 개의 종류가 있다: 크리스탈 셀, lamellocytes, 및 plasmatocytes¹³. 크리스탈 셀, 애벌레에서 순환 hemocytes의 5%를 구성 하는 병원 체와 상처 사이트에 호스트 조직의 melanization에 지도 하는 proPhenoloxidase (proPO) 효소를 놓습니다. 일반적으로에 없는 건강 한 태아 또는 애벌레, Lamellocytes는 외국 개체를 캡슐화 하는 부착 세포 이다. 이러한 셀 pupariation 또는 parasitizing 말 벌 계란은 애벌레에 예금 될 때 유발 됩니다. Phagocytic plasmatocytes, 애벌레에서 hemocytes 및 모든 나머지 hemocytes 성인 순환의 95%를 구성 하는 조직 개발 중 개장에 역할 그리고, 특히, 초파리 세포 면역의 주요 효과 기 세포로 될.

먹어서 타고 난 면역성이 있는 방위;의 즉각적이 고 중요 한 선 호스트 상피 방 벽을 위반 하는 미생물에 휩 싸이 빠르고 phagocytic 혈액 세포에 의해 제거 (식 균 작용의 세포 생물학의 종합적인 검토에 대 한 참조 ¹⁴참조). 이 프로세스는 생식 인코딩 패턴 인식 수용 체 (호흡기) hemocytes 인식 병원 체 관련 된 분자 패턴 (PAMPs) 미생물의 때 시작 됩니다. 한 번 그들의 목표에 바인딩된, 호흡기 말라 골격 개장을 통해 pseudopods의 형성으로 이어질 신호 폭포를 시작 합니다. pseudopods 잠겼습니다 이후 이며 초기 세포 기관이, 있는 phagosome로 내 면 미생물을 둘러싸고 있습니다. 미생물은 phagosome는 hemocyte의 내부로 매매 하 고 일련 리소좀과 상호 작용의 산성화는 phagosome phagosome 성숙의 과정을 겪 습으로 파괴 된다. 시험관에 세포 생물학 연구 포유류 1 차 셀에 식별 및 포유류 Fc 감마 수용 체 등 C3b 수용 체^15,16먹어서 조절 요인에 되었습니다. 그럼에도 불구 하 고, 대형 스크린 또는 vivo에서 학문을 실행 하는 능력은 포유류 시스템에서 제한 된다.

여기 우리는 2000¹⁷에 데이비드 슈나이더의 연구소에 의해 처음 도입 절차를 기반으로 성인 초파리에 있는 식 균 작용에 대 한 vivo에서 분석 결과 제시. 슈나이더 연구소 무 hemocytes 쉽게 복 부 등 혈관을 따라 클러스터링 phagocytose 폴리스 티 렌 구슬 및 박테리아를 보여주었다. 먹어서 시각화, 파리 붙일 레이블된 입자 (와 같은 E. 콜라이 fluorescein isothiocyanate (대장균-FITC)으로 표시), 주사는 hemocytes 시간을 입자를 삼 켜 수 있도록 30 분 동안 incubated 그리고 인큐베이션 기간 동안 하지 phagocytosed 입자의 형광 냉각 trypan 파랑, 함께 주입. 비행 등 혈관은 다음 거꾸로 형광 현미경을 사용 하 여 몇 군데. 이 정액 종이, 라텍스 구슬, 파리 hemocytes phagocytose 박테리아 하 고 라텍스 구슬, 그 세균 먹어서 미리 주입 하 여 저해 수 있는 상대적으로 간단한 실험을 사용 하 고는 세포와 체액 없이 면역 응답도 대장균을 따르게 됩니다. Vivo에서 먹어서 등 선박 관련 된 hemocytes에 의해 잠겼습니다 하는 입자의 형광 강도 측정 하 여 계량 슈나이더 연구소의 작품을 바탕으로이 보고서에서 제시 하는 분석 결과.

포유류 시스템에 접근 방식과 마찬가지로, 초파리 유전학 처음 사용 게놈 넓은 생체 외에서 RNAi 스크린 휴대 면역 응답^{18,19,20에 필요한 유전자를 식별 하 ,21,,2223}. 그러나, 성인 vivo에서 먹어서 분석 결과의 개발 활성화 후속 실험 체 외 연구에서 식별 된 요소의 역할 연구원 생물 학적 확인 되므로 전체 동물에 쉽게 실시 하. 막 횡단 수용 체 공룡, s 2를 사용 하는 RNAi 스크린에 세균성 수용 체 세포가²⁴ 로 처음 확인 되었고 나중 대장균 (대장균), Enterococcus 중재에 표시 된 경우 있 었 어 요 faecalis, 및 성인²⁵에 황색 포도상구균 (S. 구 균) 먹어서.

우리의 실험실 성인 hemocytes에 식 균 작용을 조절 하는 새로운 유전자를 식별 하기 위해 앞으로 유전 스크린 및 게놈 넓은 협회 연구 ( 초파리 유전자 참조 패널 (DGRP)를 사용 하 여)에서 vivo에서 먹어서 분석 결과 고용. 이러한 연구 수용 체 PGRP-SC1A 및 PGRP SA²⁶, 단백질 Rab14²⁷, 글루타민 산 염 운송업 자 Polyphemus²⁸와 RNA 의무적인 단백질 폭스-1²⁹밀매 세포내 소포 특성에 지도 했다.

우리는 미래의 화면 통합 vivo에서 먹어서 추가 유전자 초파리의 세포 면역 반응에 대 한 중요 한 식별 이어질 수 예상. 화면 완전히 시퀀싱 타고 난된, 등 라인은 DGRP 또는 초파리 합성 인구 자원 (DSPR)를 사용 하 여 식 균 작용 또는 hemocyte 개발에 영향을 미치는 자연 변종 식별할 수 있습니다. 기술은 수 초파리 의 다른 종에 채택 또는 유지로 국가 초파리 종 사진 센터 (NDSSC 250 초파리 종 컬렉션이 화면 새로운 커뮤니티 리소스를 하는 데 사용 하는 또한, ) 코넬에서. 이러한 실험 실시 될 수 있습니다. 붙일 표시 된 세균 이나 곰 팡이 벽 bioparticles 상업적으로 사용할 수 있는 사용 하 여 또는 어떤 수 종의 세균 이나 곰 팡이-는 미생물 형광 마커 표현 제공를 사용 하 여 수행할 수 있습니다. .

Protocol

1. 주입 Fluorescein 입자 준비 상용, 열 살해 박테리아의 10 밀리 그램을 다시 구성 입자 fluorescein 표시 ( 재료의 표참조) 추가 하 여 990 µ L 살 균 1 x PBS 그리고 10 µ L 50 m m 나트륨 아 지 드 10 mg/mL의 농도 재고를. 소용돌이를 섞어입니다. 단일 사용 8 µ L aliquots 0.2 mL 튜브에로 분할 하 고 빛이 관련 된 감도 최소화 하기 위해 4 ° C에서 어두운 상자에서 저장.참고: 나트륨 아 지 …

Representative Results

Vivo에서 먹어서 분석 결과 fluorescein 표시 된 입자를 사용 하 여의 회로도 그림 1A에 표시 됩니다. 파리 탑재 된 복 부 측 아래로 전기 테이프의 조각에 있으며 등 쪽 혈관이 있는 곳, 복 부의 첫번째 2 개의 세그먼트는 명확 하 게 보이는 (그림 1B). 실험적인 과실의 주요 소스는 주입 및 이미징 절차 (그림 1C)의…

Discussion

상용, 붙일 레이블 입자는 일반 (0.2 µ m 카복실산 수정 스피어)에 식 균 작용 또는 미생물 (붙일 레이블 열-화학적 살해 박테리아 또는 효 모)의 식 균 작용을 평가 하는 데 사용 됩니다. Phagosome 성숙 평가, 연구원은 입자는 phagolysosome에서 산 성 하에서 중립 pH 감소 때 fluoresces pH에 민감한 염료와 함께 표시를 선택할 수 있습니다. 또는, 먹어서, 병원 체 인식 및 이해의 초기 단계를 검사 하 ?…

Materials

0.2μm Red Fluorescent Carboxylate Modified FluoSpheres	Invitrogen	F8810	Fluorescently-labeled latex beads to test general phagocytic capacity of phagocytes. (~580/~605 nm) Inject a 1:20 dilution in PBS with 5% dye.
5430-10 PicoNozzle Kit	World Precision Instruments	5430-10	Holder for 1.0mm pipette
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate	Invitrogen	E13231	Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~495/~519 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate	Invitrogen	E23370	Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~590/~617 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Fluorescein conjugate	Invitrogen	E2861	Killed E. coli labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~494/~518 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate	Invitrogen	E2863	Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate	Invitrogen	E2863	Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm)
Needle Pipette Puller	David Kopf Instruments	Model 725
pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate for Phagocytosis	Invitrogen	P35361	Killed E. coli labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-negative bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue.
pHrodo Red S. aureus BioParticles Conjugate for Phagocytosis	Invitrogen	A10010	Killed S. aureus labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-positve bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue.
Pneumatic PicoPump PV820	World Precision Instruments	SYS-PV820	The World Precision Instruments Pneumatic PicoPump PV820 uses differential pressures to hold liquid in the glass needle between injections. The user manually controls short bursts of gas pressure to expel the liquid – allowing delivery of sub-nanoliter volumes. The amount of liquid delivered depends on two main variables – the size of the glass needle opening and the amount of time injection pressure is applied. set the instrument to 100 ms “TIMED” mode.
S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate	Invitrogen	S23371	Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~495/~519 nm)
S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate	Invitrogen	S23372	Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~590/~617 nm)
S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Fluorescein conjugate	Invitrogen	E2851	Killed S. aureus labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~494/~518 nm)
Thin Wall Glass Capillaries	World Precision Instruments	TW100F-3	Needles for injection. OD = 1.0 mm
Trypan Blue Solution (0.4%)	Sigma	T8154	Used to quench extracellular fluorescence of Fluorescein, Alexa Fluor, or Texas Red labeled particles.
ZEISS SteREO Microscope (Discovery.V8)	Zeiss	SteREO Discovery.V8	Inverted fluorescence microscope for imaging flies. Use a digital camera (example: AxioCam HC camera) and the accompanying software (example: AxioVision 4.7 software) to take pictures.
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate	Invitrogen	Z23373	Killed labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~495/~519 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate	Invitrogen	Z23374	Killed labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~590/~617 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Fluorescein conjugate	Invitrogen	Z2841	Killed labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~494/~518 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Texas Red	Invitrogen	Z2843	Killed labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~595/~615 nm)