Bedömningen av cellulära immunsvaret hos bananflugan, Drosophila melanogaster, använder ett fagocytos i Vivo test

Summary

Det här protokollet beskriver ett Invivo fagocytos test i vuxen Drosophila melanogaster att kvantifiera fagocytsystemet erkännande och clearance av mikrobiella infektioner.

Abstract

Alla djur ger medfödd immunitet en omedelbar och robust försvar mot ett brett spektrum av patogener. Humorala och cellulära immunsvaret är de viktigaste grenarna av den medfödda immuniteten, och många av de faktorer som reglerar dessa svar är evolutionärt bevarade mellan ryggradslösa djur och däggdjur. Fagocytos, den centrala komponenten i cellulär medfödd immunitet, utförs av specialiserade celler i immunsystemet. Bananflugan, Drosophila melanogaster, har vuxit fram som en kraftfull genetisk modell att undersöka molekylära mekanismer och fysiologiska effekterna av fagocytos i hela djur. Här visar vi en injektion-baserade Invivo fagocytos analysmetod för att kvantifiera partikel upptag och förstörelse av Drosophila blodkroppar, hemocytes. Förfarandet gör det möjligt för forskare att exakt kontrollera partikel koncentration och DOS, vilket gör det möjligt att få mycket reproducerbara resultat i en kort tid. Experimentet är kvantitativa, lätt att utföra, och kan användas för att skärmen för värd faktorer som påverkan patogen erkännande, upptag och clearance.

Introduction

Medfödda immunförsvar bildar den första försvarslinjen mot patogena mikrober. Dessa svar kan indelas funktionellt i humorala och cellulära medfödd immunitet, som båda medieras av könsceller-kodat mönster erkännande receptorer (PRRs) som känner av patogen-associerade molekylära mönster (PAMPs)¹. Många av signalvägar och effektor mekanismer av den medfödda immuniteten bevaras hos däggdjur och ryggradslösa djur, såsom Nematoden, Caenorhabditis elegans, och bananflugan, Drosophila melanogaster². Bananflugan har vuxit fram som ett kraftfullt system att studera värd försvar mot smittsamma mikroorganismer³. Drosophila är genetiskt eftertraktansvärda, enkelt och billigt uppfödda i laboratorier, och har en kort generationstid. Dessutom uppvisar bananflugan högeffektiva försvar mot en mängd mikrober, aktivera granskningen av värd immunitet mot virala, bakteriella, svamp eller parasiter patogener.

Drosophila Immunologer har historiskt utnyttjas framåt genetiska skärmar, genome-wide RNA-medierad störningar (RNAi) screening av insekt cellinjer, och redan existerande mutanta flyga stammar för att undersöka medfödd immunitet – leder till den identifiering och karakterisering av flera evolutionärt bevarade humorala immunsystemet vägar^4,5,6,7,8. Det humorala medfödda immunsvaret är, utan tvekan, bäst kännetecknas immunförsvar hos bananflugor. Efter infektion leder den humorala Svaren till produktion och systemisk frisättning av antimikrobiell peptid (AMP) molekyler i hemolymph, blod motsvarighet i insekter. Ampere är producerad av mycket Toll och Imd signalering vägar. Den avgiftsbelagda vägen är homolog till däggdjur TLR/IL-1R receptor signalering och Imd stigen är homolog till däggdjur tumörnekrosfaktor-alfa signalering. I Drosophila, Toll signalering framkallas av grampositiva bakterier, svampar och Drosophila X virus^6,9,10 och Imd signalering framkallas av Gramnegativa bakterier^{11 ,12}.

Cellulär immunitet, består av inkapsling, melanization och fagocytos av invaderande patogener, som utförs av specialiserade blodkroppar som kallas hemocytes¹³. Det finns tre klasser av hemocytes i bananfluga: crystal celler, lamellocytes och plasmatocytes¹³. Crystal celler, som utgör 5% av de cirkulerande hemocytes i larver, släpp proPhenoloxidase (föreslagen) enzymer leder till melanization av patogener och värd vävnader på såret platser. Lamellocytes, som normalt inte finns i friska embryon eller larver, är vidhäftande celler som inkapslar främmande föremål. Dessa celler induceras vid pupariation eller när parasitizing geting ägg deponeras i larver. Fagocytos plasmatocytes, som utgör 95% av cirkulerande hemocytes i larver och alla återstående hemocytes hos vuxna, spela en roll i vävnad remodeling under utveckling och, framför allt, fungera som den huvudsakliga effektor cellen i Drosophila cellulär immunitet.

Fagocytos en omedelbara och avgörande rad medfödda immunförsvaret; mikrober som bryter mot den värd epiteliala barriären är snabbt uppslukat och undanröjas genom fagocytos celler (se referens ¹⁴för en omfattande översyn av cellbiologi för fagocytos). Denna process initieras när könsceller-kodade mönsterigenkänning receptorer (PRRs) på hemocytes känner igen patogener associerade molekylära mönster (PAMPs) av mikrober. PRRs bindning till sina mål, och initiera signalering kaskader som leder till bildandet av pseudopods genom aktin cytoskelettet remodeling. Pseudopods omger mikrob, som därefter är uppslukade och internaliserad i en begynnande organell, phagosome. Mikrober förstörs då phagosome genomgår processen av phagosome mognad när phagosome är trafikerad mot inre av hemocyte och försurar genom en rad interaktioner med lysosomer. Vitro och cell har biologi studier i däggdjursceller primär varit instrumental i att identifiera och karaktärisera faktorer som reglerar fagocytos, såsom däggdjur Fc-gamma receptor och C3b receptorer^15,16. Möjligheten att köra storskaliga skärmar eller in vivo-studier är dock begränsade däggdjur system.

Här presenterar vi i vivo test för fagocytos i vuxen bananflugor, som bygger på ett förfarande som först introducerades av laboratoriet för David Schneider i 2000¹⁷. Schneider labbet visade att oskaftade hemocytes klustrade längs buken dorsala fartyget lätt phagocytose polystyren pärlor och bakterier. För att visualisera fagocytos, flugor injiceras med fluorescently märkta partiklar (såsom E. coli märkt med fluorescein Isotiocyanat (E. coli –FITC)), inkuberas i 30 minuter så att hemocytes tid att uppsluka partiklarna, och sedan injiceras med trypan blå, som släcker fluorescensen av partiklar inte fagocyteras under inkubationstiden. Flyga dorsala fartyg är sedan avbildas med en inverterad fluorescerande Mikroskop. Detta nyskapande papper, använder ett relativt enkelt experiment, visat att hemocytes phagocytose bakterier och latex pärlor, den bakteriella fagocytos kan hämmas genom att pre injicera flyger med latex pärlor, och som flyger utan både cellulära och humorala immunsvar är känsliga även för E. coli. Analysen presenteras i denna rapport bygger på arbete av Schneider labbet att kvantifiera Invivo fagocytos genom att mäta fluorescensintensiteten hos partiklar uppslukas av dorsala fartyget associerade hemocytes.

Liknar synsättet i däggdjur system, Drosophila genetiker användes ursprungligen genome-wide in vitro-RNAi-skärmar för att identifiera gener som krävs för den cellulära immunsvar^{18,19,20 ,21,22,23}. Men gjort utvecklingen av vuxen Invivo fagocytos analysen uppföljande experiment skall utföras lätt i hela djur, vilket tillåter forskare att verifiera biologiskt betydelsen av faktorer som identifierats i in vitro-studier. Så var fallet med transmembrana receptorn Eater, som först identifierades som en bakteriell receptor i en RNAi skärm använder S2 celler²⁴ och sedan senare visat att medla Escherichia coli (E. coli),, Enterococcus faecalis, och Staphylococcus aureus (S. aureus) fagocytos i vuxna²⁵.

Vårt labb Anställd Invivo fagocytos analysen i framåt genetiska skärmar och genome-wide associationsstudier (med Drosophila genetiska referens Panel (DGRP)) för att identifiera nya gener som reglerar fagocytos i vuxen hemocytes. Dessa studier ledde till att karakterisera receptorerna PGRP-SC1A och PGRP-SA²⁶, den intracellulära vesikler människohandel protein Rab14²⁷, glutamat transportör Polyfemos²⁸och RNA-bindande protein Fox-1²⁹.

Vi räknar med att framtida skärmar införliva den i vivo fagocytos kan leda till identifiering av ytterligare gener som är viktiga för cellulära immunsvaret i Drosophila. Skärmar med fullt sekvenserade inavlade linjer, till exempel DGRP eller Drosophila syntetiska befolkningen resurs (DSPR), kan identifiera naturliga varianter påverkar fagocytos eller hemocyte utveckling. Dessutom kan tekniken antogs i andra arter av Drosophila eller användas till skärmen nya gemenskapens medel, såsom insamling av 250 Drosophila arter upprätthålls av de nationella Drosophila arter lager Center (NDSSC ) på Cornell. Dessa experiment kan utföras med hjälp av fluorescently-märkta bakterie- eller svampinfektioner-wall biopartiklar som finns kommersiellt eller kan utföras med valfritt antal bakterie- eller svampinfektioner arter – förutsatt att mikrob uttrycker fluorescerande markörer .

Protocol

1. Förbered Fluorescein partiklar för injektion Beredes 10 mg av kommersiellt tillgängliga, värmeavdödade bakterier partiklar märkt med fluorescein (se Tabell för material) till lager koncentrationen 10 mg/mL genom att lägga till 990 µL sterilt 1 x PBS och 10 µL 50 mM natriumazid. Vortex att blanda. Dela i engångsbruk 8 µL portioner i 0,2 mL rör och förvara i en mörk låda vid 4 ° C att minimera associerade ljuskänslighet.Obs: Natriumazid konserveringsmedel är valf…

Representative Results

Figur 1Avisar en schematisk Invivo fagocytos analysens med fluorescein-märkt partiklar. Flugor är monterade ventrala sida ner på en bit eltejp och de två första segmenten av buken, där dorsala fartyget ligger, är klart synliga (figur 1B). Viktiga källor till experimentella fel uppstår vid injektionen och imaging steg av förfarandet (figur 1 c). Med samma nålen för att injicera flera flugo…

Discussion

Kommersiellt tillgängliga, fluorescently märkt partiklar används för att bedöma fagocytos i allmänhet (0.2 µm bildas modifierade mikrosfärer) eller fagocytos av mikrober (fluorescently-märkt värme – eller kemiskt dödade bakterier eller jäst). För att bedöma phagosome mognad, kan forskare välja partiklar märkt med ett pH-känsliga färgämne som fluorescerar när pH sjunker från neutral till sura, som i phagolysosome. Alternativt, för att undersöka de första stegen av fagocytos, patogen er…

Materials

0.2μm Red Fluorescent Carboxylate Modified FluoSpheres	Invitrogen	F8810	Fluorescently-labeled latex beads to test general phagocytic capacity of phagocytes. (~580/~605 nm) Inject a 1:20 dilution in PBS with 5% dye.
5430-10 PicoNozzle Kit	World Precision Instruments	5430-10	Holder for 1.0mm pipette
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate	Invitrogen	E13231	Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~495/~519 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate	Invitrogen	E23370	Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~590/~617 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Fluorescein conjugate	Invitrogen	E2861	Killed E. coli labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~494/~518 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate	Invitrogen	E2863	Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate	Invitrogen	E2863	Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm)
Needle Pipette Puller	David Kopf Instruments	Model 725
pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate for Phagocytosis	Invitrogen	P35361	Killed E. coli labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-negative bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue.
pHrodo Red S. aureus BioParticles Conjugate for Phagocytosis	Invitrogen	A10010	Killed S. aureus labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-positve bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue.
Pneumatic PicoPump PV820	World Precision Instruments	SYS-PV820	The World Precision Instruments Pneumatic PicoPump PV820 uses differential pressures to hold liquid in the glass needle between injections. The user manually controls short bursts of gas pressure to expel the liquid – allowing delivery of sub-nanoliter volumes. The amount of liquid delivered depends on two main variables – the size of the glass needle opening and the amount of time injection pressure is applied. set the instrument to 100 ms “TIMED” mode.
S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate	Invitrogen	S23371	Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~495/~519 nm)
S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate	Invitrogen	S23372	Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~590/~617 nm)
S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Fluorescein conjugate	Invitrogen	E2851	Killed S. aureus labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~494/~518 nm)
Thin Wall Glass Capillaries	World Precision Instruments	TW100F-3	Needles for injection. OD = 1.0 mm
Trypan Blue Solution (0.4%)	Sigma	T8154	Used to quench extracellular fluorescence of Fluorescein, Alexa Fluor, or Texas Red labeled particles.
ZEISS SteREO Microscope (Discovery.V8)	Zeiss	SteREO Discovery.V8	Inverted fluorescence microscope for imaging flies. Use a digital camera (example: AxioCam HC camera) and the accompanying software (example: AxioVision 4.7 software) to take pictures.
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate	Invitrogen	Z23373	Killed labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~495/~519 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate	Invitrogen	Z23374	Killed labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~590/~617 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Fluorescein conjugate	Invitrogen	Z2841	Killed labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~494/~518 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Texas Red	Invitrogen	Z2843	Killed labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~595/~615 nm)