اعداد الحساسة المحايدة ، والتي تستجيب لدرجه الحموضة البوليمر النانويه لتسليم سيرتووليك siRNA
Summary
طرق لاعداد وتوصيف الخواص الفيزيائية الكيميائية والنشاط الحيوي من المضادة للحمض المشحون ، وقدمت الأس الهيدروجيني المستجيبة لل النانويه. وتناقش معايير نجاح siRNA ادويه النانويه مثل الحجم ، والتشكل ، وتهمه السطح ، والتحميل siRNA ، وإسكات الجينات.
Abstract
يعتمد نجاح siRNA كدواء جزيئي مستهدف علي تسليم السيتوسيوليك الفعال إلى الخلايا داخل انسجه الامراض. تم تحقيق النجاح السريري لعلاج الأهداف التي كانت في السابق “غير قابله للتوصيل” للامراض الكبدية مع siRNA. ومع ذلك ، فان الولادة الفعالة سيرنا تتطلب اعتبارات التصميم الدوائية الاضافيه ، بما في ذلك وقت التداول الطويل ، والتهرب من أجهزه التخليص (علي سبيل المثال، الكبد والكلي) ، واختراق الورم والاحتفاظ به. هنا ، ونحن وصف الاعداد وفي المختبر الفيزيائية/البيولوجية توصيف الجسيمات النانويه البوليمريه المصممة لكفاءة التسليم siRNA ، وخاصه إلى الانسجه غير الكبدية مثل الأورام. ويتم اعداد جسيمات نانويه siRNA بواسطة المعقدة الكهربائية من siRNA و diblock كوبوليمر بولي (الاثيلين جلايكول-b-[2-(ديميثيلامينو) ايثيل ميثريلات-المشترك بوتيل ميثاكريلات]) (PEG-DB) لتشكيل المجمعات polyion ( بوليبليكسيس) حيث يتم عزل siRNA داخل النواة polyplex و PEG يشكل الإكليل المائي ، المحايدة المشحونة. وعلاوة علي ذلك ، فان كتله DB يصبح غشاء-lytic كما حويصلات من المسار endolysosomal (< pH 6.8) ، مما اثار الهروب الباطني والتسليم عصاري خلوي من sirna. طرق لتوصيف الخصائص الفيزيائية الكيميائية من الجسيمات النانويه siRNA مثل الحجم ، والشحن السطحي ، وتشكل الجزيئات ، و siRNA التحميل موصوفه. يتم قياس النشاط الحيوي لجسيمات نانويه sirna باستخدام لوسيفيراز كجين نموذج في الجينات السريعة والعالية الانتاجيه إسكات الفحص. وتعتبر التصاميم التي تمر هذه الاختبارات الاوليه (مثل بوليبليكسيس القائم علي الوتد DB) مناسبه للترجمة إلى الدراسات الحيوانية قبل السريرية تقييم تسليم siRNA إلى الأورام أو مواقع أخرى من علم الامراض.
Introduction
لان سيرناس تمنع ترجمه البروتينات من تسلسلات mrna ، فانها يمكن نظريا ان تستخدم للمخدرات جميع الامراض المعروفة1،2،3،4،5. ومع ذلك ، فان استخدام sirna في الطب محدود من قبل الشخصية الدوائية الفقيرة بشكل شامل من جزيئات sirna6،7. عند حقنها عن طريق الوريد ، يتم مسح سيرناس بسرعة من خلال الكلي و/أو المتدهورة من قبل نوكليسيس8،9. نظرا لحجمه الكبير والشحنة السالبة ، لا يمكن ل sirna إدخال الخلايا أو الهروب من المسار endolysosomal للوصول إلى مجمع إسكات الناجمة عن الجيش النيبالي الريبي (risc) الذي يقيم في عصارة10،11،12، 13-الآن التالي ، فقد ركزت الجهود المكثفة علي تصميم وتنفيذ استراتيجيات التسليم في سيرنا14. وقد ركز هذا الجهد إلى حد كبير علي تطوير المواد النانويه المستندة إلى الدهون والبوليمر التي حزمه sirna ، حمايته من التطهير والتدهور في الجسم المجري ، والبدء في امتصاص الخلوية والهروب الباطني من خلال مجموعات الأمين موجب المؤين. وقد تم الإبلاغ عن العديد من النجاحات قبل السريرية ومؤخرا, وقد تم الإبلاغ عن النجاح السريرية الاولي ل جسيمات متناهي المستندة إلى الولادة سيرنا الكبدية لعلاج وراثي transthyretin-توسط (حطاب) الداء النشواني15.
هناك العديد من الجينات المسببة للسرطان التي هي حاليا “غير قابله للتوصيل” من قبل الصيدلة التقليدية (اي ، المخدرات جزيء صغير) ، وتحفيز تصميم النانويه سيرنا البوليمر (si-NPs) لعلاج السرطان16. ومع ذلك ، هناك مجموعه منفصلة من معلمات التصميم التي يجب النظر فيها للتسليم غير الكبدي سيرنا. يجب ان نظام التسليم حماية المسؤول موجب من polyplex الذي يسبب التراص داخل الدورة الدموية الجهازية17,18,19. لولادة الورم ، علي وجه التحديد ، si-NP الاستقرار أمر ضروري لمنح الدورة الدموية الطويلة ، التالي زيادة تراكم داخل الأورام عن طريق نفاذيه معززه والاحتفاظ (الثوري) تاثير20،21. وعلاوة علي ذلك ، السيطرة علي حجم si-NP أمر ضروري لان الجسيمات النانويه فقط حوالي 20-200 nm القطر في حجم الرافعة المالية الثورية22، وأصغر Si-NPs (~ 20-50 nm القطر) معرض تحسين تغلغل الورم علي جسيمات نانويه أكبر حجما الجسيمات المجهرية23.
لمعالجه هذه القيود تصميم اضافيه لولادة الورم الجهازية من siRNA بعد الاداره الوريدية ، وقد وضعت المحايدة ، والاستجابة لدرجه الحموضة si-NPs (الشكل 1)24. هذه si-NPs هي PEGylated ، أو في الاونه الاخيره ، Zwitterionated25، لتهمه سطح محايد ومقاومه لامتصاص البروتين والانحلال في الدورة الدموية. نظرا لأنها لا يمكن ان تعتمد فقط علي الطابع موجب لدفع التسليم داخل الخلايا ، الهروب الباطنية فعاله للغاية أمر حتمي لتحقيق إسكات الجينات قويه. وبناء علي ذلك ، فان جوهر هذه si-NPs يتكون من نواه التنظير الباطني للغاية التي هي خاملة في الأس الهيدروجيني خارج الخلية (7.4) ، ولكن الذي يتم تشغيله بطريقه تشبه التبديل في الظروف المحمضة للمسار اندوليسومال [pH 6.8 (التنظير المبكر) – 5.0 ( lysosomes)]. وأخيرا ، فان مزيجا من المحتوي الموجب والمسعور داخل النواة الاساسيه لل si-NPs يوفر كلا من قوات تثبيت الاستقرار الكهروستاتيكية والكهربائية ، مما يحسن استقرار القوه الخاصة بالدم مقارنه بالنظم المجردة.
التكامل بين العديد من الوظائف في تصميم بسيط نسبيا هو ممكن باستخدام العكس بالاضافه إلى تجزئه سلسله نقل (طوف) التي تسيطر عليها البلمره لإنتاج البوليمرات مع الهندسة المعمارية المعقدة وتكوين دقيق. لإنتاج si-NPs مع تهمه سطح محايد ، الأس الهيدروجيني الاستجابة ، والاستقرار NP ، ويستخدم الطوافة لتوليف بولي (الاثيلين جلايكول-b-[2-(ديميثيلامينو) ايثيل ميثاكريليت-المشترك بوتيل ميثاكريلات]) (PEG-DB ؛ الشكل 1 (ا). PEG-DB هو بالكهرباء المعقدة مع siRNA ، وتشكيل si-NPs مع الكورونا شماعة و DB/siRNA الاساسيه (الشكل 1B). PEG تشكل طبقه مائية خاملة ومشحونة بالتحييد علي كورونا si-NP. كتله DB يتكون من 50:50 المولي نسبه 2-(ديميثيلامينو) ايثيل ميثلات (DMAEMA) وبوتيل ميثاكريليت (النقد الخاص). الموجبة DMAEMA المجمعات بالكهرباء سلبيا مشحونة siRNA. الشركاء الذاتيين لمؤسسه نقد البحرين داخل النواة NP بواسطة التفاعلات فان دير فالس ، وزيادة الاستقرار NP. معا ، DMAEMA والنقد الخاص نقل السلوك الدهني المعتمد علي الأس الهيدروجيني إلى كتله البوليمر DB. في الأس الهيدروجيني خارج الخلية ، يتم عزل كتله DB إلى النواة si-NP وخاملة إلى الطبقات الدهنية. في ظل الظروف الحمضية ، مثل تلك الموجودة في المسار اندوليسومال ، DMAEMA المؤين داخل كتله DB يسهل تاثير الإسفنج البروتون ، حيث يؤدي التخزين المؤقت الباطني إلى تورم اوموتيك وتمزق26. بالاضافه إلى ذلك ، فان الجماليات المائية التي تسبب رهاب الماء داخل كتله DB تدمج بشكل فعال في الطبقات الدهنية الشحمية ، مما يؤدي إلى انحلال التنظير الباطني القوي. وهكذا ، يتم معقده siRNA مع PEG-DB لتشكيل si-NPs التي هي محايده-مشحونة ومستقره للغاية في درجه الحموضة خارج الخلية ولكن الذي يعطل الطبقات الدهنية في الحموضة الحمضية ، وضمان التسليم السيتووليك من حموله siRNA.
وهنا وصفت الإجراءات التجريبية لإنتاج si-NPs من PEG-DB. يتم عرض ومناقشه طرق توصيف المعلمات الفيزيائية الكيميائية والنشاط الحيوي ل si-NPs. [أين وردر تو] سريعا قيمت [س-نب] [بيوكتيفيتي], استعملت [لوسيفيتاز] كمورثه نموذجيه ل [كالجن] دراسات. اليراع Luciferase هو البروتين المسؤول عن ‘ توهج ‘ من الحشرات27. وبناء علي ذلك ، فان الخلايا الثديية التي تمر بالجينات الملتقطة لليراع الضوئي تنتج توهجا “متوهجا” يمكن الإمساك به باستخدام مقياس الاناره لقياس مستويات تعبير لوسيفيرياز. هنا ، ونحن نستخدم Luciferase لتقييم النشاط الحيوي لل si-NPs من خلال تقديم siRNA ضد Luciferase وتحديد كميه الانخفاض المقابلة في التلالؤ الإحيائي في الخلايا التعبير Luciferase مقارنه بالخلايا التي تتلقي siRNA تدافعت.
Protocol
Representative Results
Discussion
يتم تشكيل si-NPs الموصوفة هنا من قبل جمعيه كهرباء من البوليمرات انييوني سيرنا و موجب في مجمعات polyion (بوليبليكسيس). يتم تسهيل المعقدة إلكتروستاتي من sirna وكتله db موجب من البوليمرات PEG-db عن طريق الاختلاط في انخفاض درجه الحموضة (4.0). في pH 4.0 ، DMAEMA هو protonated للغاية ، التالي كتله DB مشحونة للغاية. وهذا يضم?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويعرب أصحاب البلاغ عن امتنانهم لكل من السيد كريغ دوفال والسيدة ريبيكا كوك للوصول إلى البيانات وموارد المختبر لاجراء هذا البحث. ويعرب المؤلفون عن امتنانهم لمعهد فانديبلت للعلوم والهندسة الهندسية (VINSE) للوصول إلى أدوات DLS و TEM (NSF EPS 1004083). ويعرب أصحاب البلاغ عن امتنانهم للمؤسسة الوطنية للعلوم لدعم برنامج زمالات البحوث العليا (NSF # 1445197). ويعرب أصحاب البلاغ عن امتنانهم للمعاهد الوطنية للصحة علي الدعم المالي (المعاهد القومية للصحة R01 EB019409). ويعرب أصحاب البلاغ عن امتنانهم لبرنامج وزاره الدفاع للبحوث الطبية الموجهة من أجل الدعم المالي (OR130302 CDMRP).
Materials
| 0.45 mm pore-size syringe filters | Thermo Fisher Scientific | F25133 | 17 mm diameter, PTFE membrane |
| 0-14 pH test strips | Millipore Sigma | P4786 | |
| 10x TAE buffer | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | AM9869 | |
| 6-7.7 pH test strips | Millipore Sigma | P3536 | |
| 96-well black walled plates | Corning | 3603 | Tissue-culture treated |
| Agarose Powder | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | 16500 | |
| Citric acid monohydrate | Millipore Sigma | C1909 | |
| dibasic sodium phosphate dihydrate | Millipore Sigma | 71643 | |
| D-luciferin | Thermo Fisher Scientific | 88294 | Monopotassium Salt |
| DMEM | Gibco | 11995065 | High glucose and pyruvate |
| Ethanol | Millipore Sigma | 459836 | |
| ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | 15585011 | |
| FBS | Gibco | 26140079 | |
| loading dye | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | R0611 | |
| Luciferase siRNA | IDT | N/A | Antisense Strand Sequense: GAGGAGUUCAUUAUCAGUGCAAUUGUU Sense Strand Sequense: CAAUUGCACUGAUAAUGAACUCCT*C* *DNA bases |
| MDA-MB-231 / Luciferase (Bsd) stable cells | GenTarget Inc | SC059-Bsd | Luciferase-expressing cells sued to assess si-NP bioactivity |
| monobasic sodium phosphate monohydrate | Millipore Sigma | S9638 | |
| Scarmbled siRNA | IDT | N/A | Antisense Strand Sequense: AUACGCGUAUUAUACGCGAUUAACGAC Sense Strand Sequense: CGUUAAUCGCGUAUAAUACGCGUA*T* *DNA bases |
| square polystyrene cuvettes | Fisher Scientific | 14-955-129 | 4.5 mL capacity |
| TEM grids | Ted Pella, Inc. | 1GC50 | PELCO Center-Marked Grids, 50 mesh, 3.0mm O.D., Copper |
| Trisodium citrate dihydrate | Millipore Sigma | S1804 | |
| uranyl acetate | Polysciences, Inc. | 21447-25 |
References
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Elbashir, S. M., et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411 (6836), 494-498 (2001).
- Soutschek, J., et al. Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs. Nature. 432 (7014), 173-178 (2004).
- Hannon, G. J. RNA interference. Nature. 418, 244 (2002).
- Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., Lieberman, J. The silent treatment: siRNAs as small molecule drugs. Gene Therapy. 13 (6), 541-552 (2006).
- Wittrup, A., Lieberman, J. Knocking down disease: a progress report on siRNA therapeutics. Nature Reviews Genetics. 16 (9), 543 (2015).
- Li, H. E., Nelson, C. C., Evans, B., Duvall, C. Delivery of Intracellular-Acting Biologics in Pro-Apoptotic Therapies. Current Pharmaceutical Design. 17 (3), 293-319 (2011).
- Bartlett, D. W., Davis, M. E. Effect of siRNA nuclease stability on the in vitro and in vivo kinetics of siRNA-mediated gene silencing. Biotechnology and Bioengineering. 97 (4), 909-921 (2007).
- Zuckerman, J. E., Choi, C. H., Han, H., Davis, M. E. Polycation-siRNA nanoparticles can disassemble at the kidney glomerular basement membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 109 (8), 3137-3142 (2012).
- Dominska, M., Dykxhoorn, D. M. Breaking down the barriers: siRNA delivery and endosome escape. Journal of Cell Science. 123 (Pt 8), 1183-1189 (2010).
- Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle–mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nature Biotechnology. 31 (7), 638 (2013).
- Sahay, G., et al. Efficiency of siRNA delivery by lipid nanoparticles is limited by endocytic recycling. Nature Biotechnology. 31 (7), 653-658 (2013).
- Wittrup, A., et al. Visualizing lipid-formulated siRNA release from endosomes and target gene knockdown. Nature Biotechnology. 33 (8), 870-876 (2015).
- Kanasty, R., Dorkin, J. R., Vegas, A., Anderson, D. Delivery materials for siRNA therapeutics. Nature Materials. 12 (11), 967-977 (2013).
- Adams, D., et al. Patisiran, an RNAi Therapeutic, for Hereditary Transthyretin Amyloidosis. New England Journal of Medicine. 379 (1), 11-21 (2018).
- Dang, C. V., Reddy, E. P., Shokat, K. M., Soucek, L. Drugging the ‘undruggable’ cancer targets. Nature Reviews Cancer. 17 (8), 502 (2017).
- Alexis, F., Pridgen, E., Molnar, L. K., Farokhzad, O. C. Factors affecting the clearance and biodistribution of polymeric nanoparticles. Molecular Pharmaceutics. 5 (4), 505-515 (2008).
- Verbaan, F. J., et al. The fate of poly(2-dimethyl amino ethyl)methacrylate-based polyplexes after intravenous administration. International Journal of Pharmaceutics. 214 (1-2), 99-101 (2001).
- Lv, H., Zhang, S., Wang, B., Cui, S., Yan, J. Toxicity of cationic lipids and cationic polymers in gene delivery. Journal of Controlled Release. 114 (1), 100-109 (2006).
- Shi, J., Kantoff, P. W., Wooster, R., Farokhzad, O. C. Cancer nanomedicine: progress, challenges and opportunities. Nature Reviews Cancer. 17 (1), 20 (2016).
- Torchilin, V. Tumor delivery of macromolecular drugs based on the EPR effect. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (3), 131-135 (2011).
- Duncan, R. The dawning era of polymer therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 2 (5), 347 (2003).
- Tang, L., et al. Investigating the optimal size of anticancer nanomedicine. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 111 (43), 15344-15349 (2014).
- Nelson, C. E., et al. Balancing Cationic and Hydrophobic Content of PEGylated siRNA Polyplexes Enhances Endosome Escape, Stability, Blood Circulation Time, and Bioactivity in vivo. ACS Nano. 7 (10), 8870-8880 (2013).
- Jackson, M. A., et al. Zwitterionic Nanocarrier Surface Chemistry Improves siRNA Tumor Delivery and Silencing Activity Relative to Polyethylene Glycol. ACS Nano. , (2017).
- Akinc, A., Thomas, M., Klibanov, A. M., Langer, R. Exploring polyethylenimine-mediated DNA transfection and the proton sponge hypothesis. The Journal of Gene Medicine. 7 (5), 657-663 (2005).
- de Wet, J. R., Wood, K. V., DeLuca, M., Helinski, D. R., Subramani, S. Firefly luciferase gene: structure and expression in mammalian cells. Molecular and Cellular Biology. 7 (2), 725-737 (1987).
- Aggarwal, P., Hall, J. B., McLeland, C. B., Dobrovolskaia, M. A., McNeil, S. E. Nanoparticle interaction with plasma proteins as it relates to particle biodistribution, biocompatibility and therapeutic efficacy. Advanced Drug Delivery Reviews. 61 (6), 428-437 (2009).
- Geng, Y., et al. Shape effects of filaments versus spherical particles in flow and drug delivery. Nature Nanotechnology. 2 (4), 249 (2007).
- Chauhan, V. P., et al. Fluorescent nanorods and nanospheres for real-time in vivo probing of nanoparticle shape-dependent tumor penetration. Angewandte Chemie International Edition. 50 (48), 11417-11420 (2011).
- Chu, K. S., et al. Plasma, tumor and tissue pharmacokinetics of Docetaxel delivered via nanoparticles of different sizes and shapes in mice bearing SKOV-3 human ovarian carcinoma xenograft. Nanomedicine. 9 (5), 686-693 (2013).
- Werfel, T. A., et al. Selective mTORC2 Inhibitor Therapeutically Blocks Breast Cancer Cell Growth and Survival. Recherche en cancérologie. 78 (7), 1845-1858 (2018).
- Sarett, S. M., et al. Lipophilic siRNA targets albumin in situ and promotes bioavailability, tumor penetration, and carrier-free gene silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (32), E6490-E6497 (2017).
- Williams, M. M., et al. Intrinsic apoptotic pathway activation increases response to anti-estrogens in luminal breast cancers. Cell Death and Disease. 9 (2), 21 (2018).
- Evans, B. C., et al. Ex Vivo Red Blood Cell Hemolysis Assay for the Evaluation of pH-responsive Endosomolytic Agents for Cytosolic Delivery of Biomacromolecular Drugs. Journal of Visualized Experiments. (73), e50166 (2013).
- Werfel, T., et al. Combinatorial Optimization of PEG Architecture and Hydrophobic Content Improves siRNA Polyplex Stability, Pharmacokinetics, and Potency In vivo. Journal of Controlled Release. , (2017).
- Kilchrist, K. V., Evans, B. C., Brophy, C. M., Duvall, C. L. Mechanism of Enhanced Cellular Uptake and Cytosolic Retention of MK2 Inhibitory Peptide Nano-polyplexes. Cellular and Molecular Bioengineering. 9 (3), 368-381 (2016).
- Kilchrist, K. V., et al. Gal8 Visualization of Endosome Disruption Predicts Carrier-Mediated Biologic Drug Intracellular Bioavailability. ACS Nano. , (2019).
