細胞質 siRNA 送達のための、中立的充電された pH 応答性高分子ナノ粒子の調製
Summary
中立的の物理化学的性質および生理活性を調製および特徴付ける方法は、pH 応答性 siRNA ナノ粒子が提示される。サイズ、形態、表面電荷、siRNA ローディング、および遺伝子サイレンシングなどの siRNA 品を正常に行うための基準が議論されています。
Abstract
対象となる分子薬としての siRNA の成功は、病理組織内の細胞へのその効率的なセルゾル送達に依存する。SiRNA を用いて以前に「undruggable」肝疾患を治療するための臨床的成功が達成された。しかしながら、効率的な腫瘍 siRNA 送達には、長い循環時間、クリアランス器官 (例えば、肝臓および腎臓) の回避、および腫瘍の浸透および保持を含むさらなる薬物動態学的設計の考慮が必要性がある。ここでは、効率的な siRNA 送達、特に腫瘍などの非肝組織に対して設計されたポリマーナノ粒子の調製およびインビトロ物理化学/生物学的特性評価について説明する。SiRNA ナノ粒子は、siRNA の静電ビスホスホンとジブロック共重合体ポリ (エチレングリコール-b-[2-(dimethylamino) エチルメタクリレート-共ブチルメタクリレート]) (PEG-DB) によって調製され、ポリイオン錯体を形成します (polyplexes) は、siRNA がポリプレックスコア内に隔離されており、PEG は親水性の中立的を帯びたコロナを形成します。さらに、DB ブロックは、endolysosomal 経路酸性化 (< pH 6.8) の小胞として膜溶菌となり、siRNA のエンドソームのエスケープおよび細胞質送達をトリガする。サイズ、表面電荷、粒子形態、および siRNA ローディングなどの siRNA ナノ粒子の物理化学的特性を特徴付ける方法について説明する。SiRNA ナノ粒子の生理活性は、迅速かつハイスループットな遺伝子サイレンシングアッセイにおけるモデル遺伝子としてのルシフェラーゼを用いて測定される。これらの初期試験 (PEG − DB ベースの polyplexes など) を通過する設計は、腫瘍または他の病理部位への siRNA の送達を評価する前臨床動物研究への翻訳に適していると考えられる。
Introduction
Sirna は、mRNA 配列からのタンパク質の翻訳を阻害するので、理論的にはすべての既知の病理1、2、3、4、5に薬物を使用することができます。しかし、薬における sirna の使用は、sirna 分子6、7の包括的に貧弱な薬物動態学的プロファイルによって制限される。静脈内に注射すると、sirna は腎臓を通して急速に取り除かれ、ヌクレアーゼ8,9によって劣化します。大きいサイズおよび否定的な充満が原因で、siRNA は細胞質10、11、12に常駐する RNA 誘発性サイレンシング複合体 (RISC) にアクセスするためにセルに入るか、または endolysosomal 経路を逃れることができません。 13.したがって、広範な努力は、siRNA 送達戦略14の設計および実施に焦点を当ててきた。この取り組みは、siRNA をパッケージングする脂質およびポリマーベースのナノ粒子の開発に主に焦点を当てており、それをインビボでのクリアランスおよび分解から保護し、ionizable、カチオンアミン基を介して細胞取り込みおよびエンドソームエスケープを開始する。多くの臨床上の成功が報告されており、最近では、遺伝性 transthyretin 媒介性 (hATTR) アミロイドーシス15を治療するためのナノ粒子系肝 siRNA 送達について最初の臨床的成功が報告されている。
従来の薬理学 (すなわち、低分子薬) によって現在「undruggable」されている多くの癌原因遺伝子があり、癌16を治療するために高分子 siRNA ナノ粒子 (Si-NPs) の設計を動機付ける。ただし、非肝性 siRNA 送達について考慮しなければならない設計パラメータの別個のセットがあります。送達システムは、体循環17、18、19内に凝集を引き起こすポリプレックスのカチオン電荷を遮蔽しなければならない。腫瘍送達のために、具体的には、si − NP 安定性は、長期循環を見識するために不可欠であり、したがって、増強された透過性および保持 (EPR) 効果を介して腫瘍内で蓄積を増加する作用20、21。さらに、si-NP サイズに対する制御は、約20〜 200 nm の直径のサイズをレバレッジ EPR22、およびより小さい Si-NPs (〜 20-50 nm の直径) より大きいサイズのナノ粒子上の腫瘍の浸透を改善し、微粒子23。
静脈内投与後の siRNA の全身性腫瘍送達のためのこれらの追加的な設計制約に対処するために、中立的、pH 応答性 si − NPs が開発されている (図 1)24。これらの si NPs は、ペグ化、または最も最近では、Zwitterionated25、中性表面電荷および循環におけるタンパク質吸着および opsonization に対する耐性のためです。細胞内送達を駆動するためにカチオン性の特性だけに頼ることができないため、強力な遺伝子サイレンシングを達成するためには非常に効率の良いエンドソームエスケープが不可欠です。したがって、これらの si NPs のコアは、細胞外 pH (7.4) で不活性である高 endosomolytic コアで構成されていますが、endolysosomal 経路の酸性化条件でスイッチ状にトリガされます [pH 6.8 (初期エンドソーム)-5.0 (リソソーム)]。最後に、si-NPs のコア内のカチオンと疎水性の含有量の混合物は、静電とファンデルワールスの両安定化力を提供し、単なるカチオン系と比較して、血液中の si-NPs の安定性を改善します。
比較的単純な設計への多くの機能の統合は、可逆的な追加-フラグメンテーション連鎖伝達 (ラフト) 制御された重合を使用して、複合建築と精密組成でポリマーを生成することが可能である。中性表面電荷、pH 応答性、および NP 安定性を備えた si-NPs を生成するために、筏は、ポリ (エチレングリコール-b-[2-(dimethylamino) エチルメタクリレート-共ブチルメタクリレート]) (PEG-DB を合成するために使用されます。図 1a)。PEG-DB は siRNA と複合化された静電的で、PEG 化コロナと DB/siRNA コアを有する si-NPs を形成します (図 1b)。PEG は、si-NP コロナ上に不活性で中立的に帯電した親水性層を形成します。DB ブロックは、2-(dimethylamino) エチルメタクリレート (DMAEMA) およびブチルメタクリレート (BMA) の50:50 モル比で構成されています。カチオン性 DMAEMA 静電的複合体負荷電 siRNA。BMA はファンデルワールス相互作用によって NP コア内で自己アソシエートし、NP 安定性を増加させます。共に、DMAEMA および BMA は DB ポリマーブロックに pH 依存性脂質二重膜溶菌挙動を付与する。細胞外 pH では、DB ブロックは si-NP コアに隔離され、脂質りんに対して不活性です。Endolysosomal 経路内のもののような酸性条件下では、DB ブロック内の ionizable DMAEMA はプロトンスポンジ効果を促進し、そこでエンドソームバッファリングは浸透圧膨潤および破裂26につながる。さらに、DB ブロック内の疎水性の BMA 部分は、溶解脂質りんに積極的に統合し、強力な endosomolysis をもたらす。したがって、siRNA は PEG-DB と複合化され、細胞外 pH では中立的で非常に安定であり、酸性 pH でりん脂質を破壊し、siRNA ペイロードの質細胞送達を確実にします。
ここでは、PEG-DB から si-NPs を製造するための実験的手順について説明する。Si-NPs の物理化学的パラメーターと生理活性を特徴付ける方法を紹介し、議論します。Si-NP 生理活性を迅速に評価するため、ノックダウン研究のためのモデル遺伝子としてルシフェラーゼを使用しています。ホタルルシフェラーゼは、ホタル27の「輝き」の原因となるタンパク質です。したがって、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を導入した哺乳動物細胞は、ルミノメーターを用いて捕捉できる生物発光「グロー」を生成し、ルシフェラーゼ発現のレベルを定量化することができます。ここではルシフェラーゼを用いてルシフェラーゼの生理活性を評価し、それに対して、スクランブル siRNA を受ける細胞と比較して、ルシフェラーゼ発現細胞における生物発光の減少を定量化しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明する si NPs は、アニオン性 siRNA とカチオン化ポリマーの静電的な関連によってポリイオン複合体 (polyplexes) に形成される。SiRNA の静電錯化、および PEG − DB ポリマーのカチオン DB ブロックは、低 pH (4.0) で混合することにより促進される。PH 4.0 では、DMAEMA は高度にプロトン化されており、その結果、DB ブロックが高充電されます。これにより、ポリマーが unimers として溶解し、ミ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者たちは、クレイグ・デュヴァルとレベッカ・クックに感謝し、この研究を行うためのデータとラボ・リソースへのアクセスを担当している。著者たちは、ヴァンダービルト研究所 (VINSE) に DL および TEM (NSF EPS 1004083) 装置へのアクセスを感謝している。著者は、大学院研究フェローシッププログラム (NSF # 1445197) を支援するための全米科学財団に感謝しています。著者は、財政支援のための国立衛生研究所 (NIH R01 EB019409) に感謝しています。著者たちは、Congressionally の金融支援研究プログラム (DOD CDMRP OR130302) の国防総省に感謝しています。
Materials
| 0.45 mm pore-size syringe filters | Thermo Fisher Scientific | F25133 | 17 mm diameter, PTFE membrane |
| 0-14 pH test strips | Millipore Sigma | P4786 | |
| 10x TAE buffer | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | AM9869 | |
| 6-7.7 pH test strips | Millipore Sigma | P3536 | |
| 96-well black walled plates | Corning | 3603 | Tissue-culture treated |
| Agarose Powder | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | 16500 | |
| Citric acid monohydrate | Millipore Sigma | C1909 | |
| dibasic sodium phosphate dihydrate | Millipore Sigma | 71643 | |
| D-luciferin | Thermo Fisher Scientific | 88294 | Monopotassium Salt |
| DMEM | Gibco | 11995065 | High glucose and pyruvate |
| Ethanol | Millipore Sigma | 459836 | |
| ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | 15585011 | |
| FBS | Gibco | 26140079 | |
| loading dye | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | R0611 | |
| Luciferase siRNA | IDT | N/A | Antisense Strand Sequense: GAGGAGUUCAUUAUCAGUGCAAUUGUU Sense Strand Sequense: CAAUUGCACUGAUAAUGAACUCCT*C* *DNA bases |
| MDA-MB-231 / Luciferase (Bsd) stable cells | GenTarget Inc | SC059-Bsd | Luciferase-expressing cells sued to assess si-NP bioactivity |
| monobasic sodium phosphate monohydrate | Millipore Sigma | S9638 | |
| Scarmbled siRNA | IDT | N/A | Antisense Strand Sequense: AUACGCGUAUUAUACGCGAUUAACGAC Sense Strand Sequense: CGUUAAUCGCGUAUAAUACGCGUA*T* *DNA bases |
| square polystyrene cuvettes | Fisher Scientific | 14-955-129 | 4.5 mL capacity |
| TEM grids | Ted Pella, Inc. | 1GC50 | PELCO Center-Marked Grids, 50 mesh, 3.0mm O.D., Copper |
| Trisodium citrate dihydrate | Millipore Sigma | S1804 | |
| uranyl acetate | Polysciences, Inc. | 21447-25 |
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