Droplet Digital TRAP (ddTRAP): anpassning av telomere upprepa amplifiering protokoll till droplet Digital polymerase kedje reaktion
Summary
Vi konverterade framgångs rikt standarden telomer upprepa amplifiering protokoll (trap) assay som skall användas i droplet Digital polymeras kedje reaktioner. Denna nya analys, som kallas ddtrap, är känsligare och kvantitativa, vilket möjliggör bättre detektion och statistisk analys av telomeras aktivitet inom olika mänskliga celler.
Abstract
Den telomer upprepa amplifiering protokoll (trap) är den mest använda analysen för att upptäcka telomeras aktivitet inom ett givet ett prov. Polymeras kedje reaktion (PCR)-baserad metod möjliggör robusta mätningar av enzym aktivitet från de flesta celllysater. Den gel-baserade trap med fluorescensmarkerade märkt primers begränsar prov genom strömning, och förmågan att upptäcka skillnader i prover är begränsad till två gånger eller större förändringar i enzym aktivitet. Droplet Digital TRAP, ddTRAP, är ett mycket känsligt tillvägagångs sätt som har modifierats från den traditionella TRAP-analysen, vilket gör det möjligt för användaren att utföra en robust analys på 96 prover per körning och få absolut kvantifiering av DNA (Telomerase extension produkter ) inom varje PCR-ingång. Därför övervinner den nyutvecklade ddTRAP-analysen begränsningarna hos den traditionella gel-baserade TRAP-analysen och ger en mer effektiv, noggrann och kvantitativ metod för att mäta telomerasaktiviteten inom laboratorie-och kliniska miljöer.
Introduction
Telomerer är dynamiska DNA-proteinkomplex i ändarna av linjära kromosomer. Humana telomerer består av en matris av 5 ‘-TTAGGGn hexameric repetitioner som varierar i längd mellan 12-15 kilobases (KB) vid födseln1. Human telomeras, det ribonukleoprotein-enzym som upprätthåller telomererna, identifierades först i HeLa celllysat (cancer cellinjen)2. Tillsammans spelar telomerer och telomeras en viktig roll i ett spektrum av biologiska processer såsom genomskydd, gen reglering och cancer cells odödlighet3,4,5,6.
Human telomeras består huvudsakligen av två viktiga komponenter, nämligen telomeras omvänt transkriptas och telomeras RNA (hTERT respektive hTERC). Proteinet subunit, hTERT, är katalytiskt aktiv omvänt transkriptase komponenten i telomeras enzymet. RNA-mallen, hTERC, ger telomeras med mallen för att utvidga och/eller underhålla telomerer. De flesta humana somatiska vävnader har ingen detekterbar telomerasaktivitet. Oförmågan hos DNA-polymeras att förlänga slutet av den släpar strängen av DNA tillsammans med avsaknaden av telomeras leder till en progressiv förkortning av telomerer efter varje runda av cellulära Division. Dessa fenomen leder till telomerförkortning i de flesta somatiska celler tills de når en kritiskt förkortad längd, varvid cellerna kommer in i ett tillstånd av replikativ senescens. Det maximala antalet gånger en cell kan dela styrs av dess telomerlängd och detta block till fortsatt cell delning tros förhindra progression till onkogenes7. Cancer celler kan övervinna telomer-inducerad replikativ senescens och fortsätta att förökar sig genom att använda telomeras att bibehålla sina telomerer. Cirka 90% av cancer aktivera telomeras, vilket gör telomeras aktivitet kritiskt viktigt i både cancer upptäckt och behandling.
Utvecklingen av TRAP-analysen på 1990-talet bidrog till identifieringen av de nödvändiga komponenterna i telomerasenzymet, liksom för mätning av telomeras i ett brett spektrum av celler och vävnader, både normala och cancerösa. Den ursprungliga gel-baserade PCR-test som används radioaktivt märkt DNA-substrat för att upptäcka telomeras aktivitet. I 2006, var analysen anpassas till en icke-radioaktiv form med fluorescensmarkerade märkta substrat8,9. Genom att använda fluorescensmarkerade märkt substrat, användare kunde visualisera telomeras förlängningen produkter som band på en gel genom att utsätta den för rätt excitation våglängd. Känsligheten hos trap-analysen och dess förmåga att detektera telomerasaktivitet i råa celllysater har gjort detta test till den mest använda metoden för att upptäcka telomeras-aktiviteter. TRAP-analysen har dock begränsningar. Analysen är gel-baserad, vilket gör det svårt att utföra de nödvändiga replikaten i måttlig till hög genom strömning studier, och därför är korrekt statistisk analys sällan uppnås. Dessutom är den gelbaserade analysen svår att kvantifiera på grund av oförmågan att upptäcka mindre än dubbla skillnader i telomerasaktivitet mellan proverna. Att övervinna dessa två begränsningar är avgörande för enzymatiska aktivitet analyser såsom trap att flytta till kliniska eller industri inställningar för detektion av telomeras aktivitet i patientprover eller studier läkemedels design.
Digital PCR utvecklades initialt i 1999 som ett sätt att omvandla den exponentiella och analoga karaktären av PCR till en linjär och digital analys10. Droplet Digital PCR (ddPCR) är den senaste innovationen av den ursprungliga digitala PCR-metodiken. Droplet Digital PCR kom omkring med tillkomsten av avancerade mikrofluidik och olja-i-vatten emulsion kemi för att tillförlitligt generera stabila och lika stora droppar. Till skillnad från gelbaserad och även kvantitativ PCR (qPCR) genererar ddPCR absolut kvantifiering av indatamaterialet. Nyckeln till ddPCR är att generera ~ 20 000 individuella reaktioner genom att partitionera proverna i droppar. Efter punkt PCR skannar DROPP läsaren varje droppe i en flödescytometerliknande mode, räknar, dimensionering och registrerar närvaron eller frånvaron av fluorescens i varje enskild droppe (dvs. frånvaro eller förekomst av PCR-amplikoner i varje droplet). Sedan, med Poissons fördelning, beräknas ingångs molekylerna utifrån förhållandet mellan positiva droppar och det totala antalet droppar. Detta tal representerar en uppskattning av antalet ingångs molekyler i varje PCR. Dessutom är ddPCR utförs och analyseras på en 96-brunn platta som gör det möjligt för användaren att köra många prover, samt utföra biologiska och tekniska replikat för ordentlig statistisk analys. Som ett resultat har vi kombinerat den kraftfulla kvantifiering och måttlig-genomflöde karaktär ddPCR med TRAP-analysen för att utveckla ddTRAP-analysen11. Denna analys är utformad för användare att studera och kraftfullt kvantifiera absolut telomeras aktivitet från biologiska prover11,12. Känsligheten hos ddTRAP gör det möjligt att kvantifiera telomerasaktiviteten från begränsade och värdefulla prover, inklusive encellig mätning. Dessutom, användare kan också studera effekterna av telomeras manipulationer och/eller droger med absolut kvantifiering av mindre än två förändringar (~ 50% skillnader). Den ddTRAP är den naturliga utvecklingen av TRAP-analysen i den digitala och högre genom strömning karaktär moderna laboratorie experiment och kliniska inställningar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mätningen av telomeras aktivitet är kritisk till en uppsjö av forsknings ämnen inklusive, men inte begränsat till, cancer, telomerbiologi, åldrande, regenerativ medicin, och strukturbaserad läkemedels design. Telomerase RNPs är låg riklig, även i cancer celler, vilket gör upptäckten och studiet av detta enzym utmanande. I detta dokument beskrev vi steg-för-steg-procedurer för den nyutvecklade ddTRAP-analysen för att kraftfullt kvantifiera telomerasaktiviteten i cellerna. Genom att kombinera den traditionel…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna skulle vilja erkänna finansiering källor från de nationella instituten för hälsa (NIH) (NCI-R00-CA197672-01A1). Små cell lung cancer linjer (SHP77 och H82) var en generös gåva från DRS. John Minna och ADI Gazdar från UT Southwestern Medical Center.
Materials
| 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Ambion | AM9855G | RNAse/DNAse free |
| 1 M MgCl2 | Ambion | AM9530G | RnAse/DNAse free |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Ambion | AM9261 | RNAse/DNAse free |
| Surfact- Amps NP-40 | Thermo Scientific | 28324 | |
| 100% Ultrapure Glycerol | Invitrogen | 15514011 | RNAse/DNAse free |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Thermo Scientific | 36978 | Powder |
| 2-Mercaptoethanol | SIGMA-ALDRICH | 516732 | |
| Nuclease Free H20 | Ambion | AM9932 | RNAse/DNAse free |
| 2.5 mM dNTP mix | Thermo Scientific | R72501 | 2.5 mM of each dATP, dCTP, dGTP and dTTP |
| 2 M KCl | Ambion | AM9640G | RNAse/DNAse free |
| 100% Tween-20 | Fisher | 9005-64-5 | |
| 0.5 M EGTA pH 8.0 | Fisher | 50-255-956 | RNAse/DNAse free |
| Telomerase Substrate (TS) Primer | Integrated DNA Technology (IDT) | Custom Primer (HPLC Purified) | 5'- AATCCGTCGAGCAGAGTT-3' |
| ACX (Revers) Primer | Integrated DNA Technology (IDT) | Custom Primer (HPLC Purified) | 5'- GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC -3' |
| Thin walled (250 ul) PCR grade tubes | USA Scientific | 1402-2900 | strips, plates, tubes etc. |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | Bio Rad | 1864034 | |
| Twin-Tec 96 Well Plate | Fisher | Eppendorf 951020362 | |
| Piercable foil heat seal | Bio Rad | 1814040 | |
| Droplet generator cartidges (DG8) | Bio Rad | 1863008 | |
| Droplet generator oil | Bio Rad | 1863005 | |
| Droplet generator gasket | Bio Rad | 1863009 | |
| 96-well Thermocycler T100 | Bio Rad | 1861096 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio Rad | 1814000 | |
| QX200 Droplet Reader and Quantasoft Software | Bio Rad | 1864001 and 1864003 | |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio Rad | 1863004 | |
| Nuclease Free Filtered Pipette Tips | Thermo Scientific | 10 ul, 20 ul , 200 ul and 1000 ul |
References
- Frenck, R. W., Blackburn, E. H., Shannon, K. M. The rate of telomere sequence loss in human leukocytes varies with age. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (10), 5607-5610 (1998).
- Morin, G. B. The human telomere terminal transferase enzyme is a ribonucleoprotein that synthesizes TTAGGG repeats. Cell. 59 (3), 521-529 (1989).
- de Lange, T. How telomeres solve the end-protection problem. Science. 326 (5955), 948-952 (2009).
- Shay, J. W., Wright, W. E. Role of telomeres and telomerase in cancer. Seminars in Cancer Biology. 21 (6), 349-353 (2011).
- Kim, W., Shay, J. W. Long-range telomere regulation of gene expression: Telomere looping and telomere position effect over long distances (TPE-OLD). Differentiation. 99, 1-9 (2018).
- Robin, J. D., et al. Telomere position effect: regulation of gene expression with progressive telomere shortening over long distances. Genes Development. 28 (22), 2464-2476 (2014).
- Shay, J. W., Wright, W. E. Senescence and immortalization: role of telomeres and telomerase. Carcinogenesis. 26 (5), 867-874 (2005).
- Norton, J. C., Holt, S. E., Wright, W. E., Shay, J. W. Enhanced detection of human telomerase activity. DNA Cell Biology. 17 (3), 217-219 (1998).
- Herbert, B. S., Hochreiter, A. E., Wright, W. E., Shay, J. W. Nonradioactive detection of telomerase activity using the telomeric repeat amplification protocol. Nature Protocols. 1 (3), 1583-1590 (2006).
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236-9241 (1999).
- Ludlow, A. T., et al. Quantitative telomerase enzyme activity determination using droplet digital PCR with single cell resolution. Nucleic Acids Research. 42 (13), e104 (2014).
- Huang, E. E., et al. The Maintenance of Telomere Length in CD28+ T Cells During T Lymphocyte Stimulation. Scientific Reports. 7 (1), 6785 (2017).
- Ludlow, A. T., Shelton, D., Wright, W. E., Shay, J. W. ddTRAP: A Method for Sensitive and Precise Quantification of Telomerase Activity. Methods Molecular Biology. 1768, 513-529 (2018).
