Vi demonstrerer en enkelt cellekultur af bakterier inde i gigantiske vesikler (GVs). GVS indeholdende bakterieceller blev fremstillet ved dråbe overførselsmetoden og blev immobiliseret på en understøttet membran på et glas substrat for direkte observation af bakterievækst. Denne fremgangsmåde kan også tilpasses andre celler.
Vi udviklede en metode til dyrkning af bakterieceller på enkelt celleniveau inde i gigantiske vesikler (GVs). Bakteriel cellekultur er vigtigt for at forstå funktionen af bakterieceller i det naturlige miljø. På grund af teknologiske fremskridt kan forskellige bakteriecelle funktioner afsløres på enkelt celleniveau inde i et lukket rum. GVS er sfæriske mikro-størrelse rum består af amfifile lipid molekyler og kan holde forskellige materialer, herunder celler. I dette studie blev en enkelt bakteriecelle indkapslet i 10 – 30 μm GVS ved dråbe overførselsmetoden, og GVS indeholdende bakterieceller blev immobiliseret på en understøttet membran på et glas substrat. Vores metode er nyttig til at observere real-time vækst af enkelte bakterier inde i GVs. Vi dyrkede Escherichia coli (E. coli) celler som en model inde i GVS, men denne metode kan tilpasses andre celletyper. Vores metode kan anvendes inden for videnskab og industri inden for mikrobiologi, biologi, bioteknologi og syntetisk biologi.
Kulturen af bakterieceller på enkelt celleniveau har fået stigende opmærksomhed. Dyrkning af bakterieceller på enkelt celleniveau inde i et lukket rum kan belyse bakterielle funktioner som fænotypiske variabilitet1,2,3,4, celle adfærd5, 6 , 7 , 8 , 9og antibiotikaresistens10,11. På grund af de seneste fremskridt inden for kultur teknikker, kan kulturen af enkelte bakterier opnås inde i et lukket rum, såsom i en brønd-chip4,7,8, gel dråbe12,13 og vand-i-olie (W/O) dråbe5,11. For at fremme forståelsen eller udnyttelsen af enkelte bakterieceller er der behov for yderligere tekniske udviklinger af dyrkningsteknikker.
Vesikler, der efterligner den biologiske celle membran er sfæriske rum bestående af amphifilic molekyler og kan holde forskellige materialer. Vesikler klassificeres efter størrelse og omfatter små vesikler (SVs, diameter < 100 nm), store vesikler (LVs, 1 μm). SVs eller LVs er almindeligt anvendt som lægemiddelbærere på grund af deres affinitet til den biologiske celle membran14. GVs er også blevet brugt som et reaktor system til opførelse af protoceller15 eller kunstige celler16. Indkapsling af biologiske celler i GVS er blevet rapporteret17,18, og dermed GVS viser potentiale som et cellekultursystem, når det kombineres med reaktor systemet.
Her, sammen med en video af eksperimentelle procedurer, vi beskriver, hvordan GVs kan bruges som nye celle-kultur fartøjer19. GVS indeholdende bakterier blev lavet af dråbe Transfer metode20 og blev derefter immobiliseret på en understøttet membran på et cover glas. Vi brugte dette system til at observere bakterievækst på enkelt celleniveau inde i GVs i realtid.
Her beskriver vi en metode til dyrkning af bakterieceller på enkelt celleniveau i GVs. Denne enkle metode indebærer at danne GVS indeholdende bakterieceller på enkelt celleniveau ved hjælp af dråbe overførselsmetoden. Sammenlignet med andre tilgange til opnåelse af GVs indeholdende bakterieceller, denne metode har to fordele: (i) det er let at udvikle, og (II) en lille mængde (2 μL) af prøven opløsning er nødvendig for at forberede GVs. Dråbe overførings metoden20 til klargøring af …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af et førende initiativ for fremragende unge forskere (LEADER, nr. 16812285) fra ministeriet for uddannelse, kultur, sport, videnskab og teknologi (MEXT) i Japan, et tilskud-i-støtte til unge videnskabsmænd forskning (no. 18K18157, 16K21034) fra Japan Society for fremme af videnskab (JSPS) til M.M., og tilskuds-in-Aid fra MEXT til K.K. (nr. 17H06417, 17H06413).
Bactotryptone | BD Biosciences | 211705 | |
Chloroform | Wako Pure Chemicals | 032-21921 | |
Cover glass (18 × 18 mm) | Matsunami Glass Ind. | C018181 | thickness 0.13–0.17 mm |
Cover glass (30 × 40 mm) | Matsunami Glass Ind. | custom-order | thickness 0.25–0.35 mm |
Desktop centrifuge | Hi-Tech Co. | ATT101 | swing rotor type |
Double-faced seal (10 × 10 × 1 mm) | Nitoms | T4613 | |
Glass vial | AS ONE | 6-306-01 | Durham fermentation tube |
Glucose | Wako Pure Chemicals | 049-31165 | |
Inverted microscope | Olympus | IX-73 | |
Methanol | Wako Pure Chemicals | 133-16771 | |
Microscopic heating stage system | TOKAI HIT | TP-110R-100 | |
Mineral oil | Nacalai Tesque | 23334-85 | |
Mini-extruder | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
Neutravidin | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
Objective lens | Olympus | LUCPLFLN 40×/0.6 NA | |
Polycarbonate membranes | Avanti Polar Lipids | 610005 | pore size 100 nm |
sCMOS camera | Andor | Zyla 4.2 plus | |
Sodium chloride | Wako Pure Chemicals | 191-01665 | |
Sucrose | Wako Pure Chemicals | 196-00015 | |
Ultrasonic bath | AS ONE | ASU-3D | |
Yeast extract | BD Biosciences | 212750 | |
0.6 mL lidded plastic tube | Watson | 130-806C | |
1.5 mL lidded plastic tube | Sumitomo Bakelite Co. | MS4265-M | |
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocoline | Avanti Polar Lipids | 850457P | POPC |
1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] | Avanti Polar Lipids | 880129P | Biotin-PEG-DSPE |