Bakteriell Cell kultur på single-cellenivå Inside Giant blemmer
Summary
Vi demonstrerer én cellekultur av bakterier inne gigantiske blemmer (GVs). GVs inneholdende bakterielle celler ble utarbeidet av dråpe overføringsmetoden og ble immobilisert på en støttet membran på et glass substrat for direkte observasjon av bakteriell vekst. Denne tilnærmingen kan også tilpasses andre celler.
Abstract
Vi utviklet en metode for å dyrking bakterieceller på enkelt cellenivå inne gigantiske blemmer (GVs). Bakteriell cellekultur er viktig for å forstå funksjonen av bakterielle celler i det naturlige miljøet. På grunn av teknologiske fremskritt, kan ulike bakterielle celle funksjoner bli avslørt på enkelt cellenivå inne i et trangt sted. GVs er sfæriske mikro-sized avdelinger bestående av amfifile lipid molekyler og kan holde ulike materialer, inkludert celler. I denne studien, en enkelt bakteriell celle ble innkapslet i 10-30 μm GVs av dråpe overføringsmetoden og GVs inneholder bakterielle celler ble immobilisert på en støttet membran på et glass substrat. Vår metode er nyttig for å observere sann tids veksten av enkelt bakterier inne i GVs. Vi kultivert Escherichia coli (E. coli) celler som en modell inni GVs, men denne metoden kan tilpasses andre celletyper. Vår metode kan brukes i vitenskap og industrielle felt av mikrobiologi, biologi, bioteknologi og syntetisk biologi.
Introduction
Kulturen av bakterielle celler på ett cellenivå har fått økende oppmerksomhet. Dyrking bakterieceller på enkelt cellenivå inne i et trangt sted kan belyse bakterie funksjoner som fenotypiske variasjon1,2,3,4, celle adferd5, 6 andre priser , 7 andre er , 8 på alle , 9, og antibiotikaresistens10,11. På grunn av nylige fremskritt innen kultur teknikker, kan kulturen i enkelt bakterier oppnås inne i et trangt sted, for eksempel i en brønn-chip4,7,8, gel dråpe12,13 og vann-i-olje (W/O) dråpe5,11. For å fremme forståelse eller utnyttelse av enkelt bakterielle celler, er ytterligere tekniske utviklingen av dyrking teknikker nødvendig.
Blemmer som etterligner den biologiske cellemembranen er sfæriske avdelinger bestående av amfifile molekyler og kan holde ulike materialer. Blemmer er klassifisert i henhold til størrelse og inkluderer små blemmer (SVs, diameter < 100 NM), store blemmer (LVs, 1 μm). SVs eller LVs brukes ofte som legemiddel bærere på grunn av deres affinitet til den biologiske cellemembranen14. GVs har også blitt brukt som en reaktor system for bygging av protocells15 eller kunstige-celler16. Innkapsling av biologiske celler i GVs har blitt rapportert17,18, og dermed GVs vise potensial som en cellekultur system kombinert med reaktoren systemet.
Her, sammen med en video av eksperimentelle prosedyrer, beskriver vi hvordan GVs kan brukes som romanen celle-kultur fartøy19. GVs inneholdende bakterier ble gjort av dråpe overføringsmetoden20 og ble deretter immobilisert på en støttet membran på et dekkglass. Vi brukte dette systemet til å observere bakteriell vekst på single-cellenivå inne GVs i sanntid.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskriver vi en metode for dyrking av bakterieceller på enkelt cellenivå inne i GVs. Denne enkle metoden innebærer forming GVs inneholder bakterielle celler på enkelt cellenivå ved hjelp av dråpe overføringsmetoden. Sammenlignet med andre tilnærminger for å skaffe GVs som inneholder bakterieceller, har denne metoden to fordeler: (i) det er lett å utvikle seg, og (II) et lite volum (2 μL) av prøve løsningen er nødvendig for å klargjøre GVs. Dråpe overføringsmetoden20 for frems…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av en ledende initiativ for Excellent unge forskere (LEADER, no. 16812285) fra departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi (MEXT) i Japan, en Grant-in-Aid for unge forsker forskning (nr. 18K18157, 16K21034) fra Japan Society for fremme av Science (JSP) til M.M., og Grant-in-Aid fra MEXT til K.K. (nr. 17H06417, 17H06413).
Materials
| Bactotryptone | BD Biosciences | 211705 | |
| Chloroform | Wako Pure Chemicals | 032-21921 | |
| Cover glass (18 × 18 mm) | Matsunami Glass Ind. | C018181 | thickness 0.13–0.17 mm |
| Cover glass (30 × 40 mm) | Matsunami Glass Ind. | custom-order | thickness 0.25–0.35 mm |
| Desktop centrifuge | Hi-Tech Co. | ATT101 | swing rotor type |
| Double-faced seal (10 × 10 × 1 mm) | Nitoms | T4613 | |
| Glass vial | AS ONE | 6-306-01 | Durham fermentation tube |
| Glucose | Wako Pure Chemicals | 049-31165 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX-73 | |
| Methanol | Wako Pure Chemicals | 133-16771 | |
| Microscopic heating stage system | TOKAI HIT | TP-110R-100 | |
| Mineral oil | Nacalai Tesque | 23334-85 | |
| Mini-extruder | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| Neutravidin | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
| Objective lens | Olympus | LUCPLFLN 40×/0.6 NA | |
| Polycarbonate membranes | Avanti Polar Lipids | 610005 | pore size 100 nm |
| sCMOS camera | Andor | Zyla 4.2 plus | |
| Sodium chloride | Wako Pure Chemicals | 191-01665 | |
| Sucrose | Wako Pure Chemicals | 196-00015 | |
| Ultrasonic bath | AS ONE | ASU-3D | |
| Yeast extract | BD Biosciences | 212750 | |
| 0.6 mL lidded plastic tube | Watson | 130-806C | |
| 1.5 mL lidded plastic tube | Sumitomo Bakelite Co. | MS4265-M | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocoline | Avanti Polar Lipids | 850457P | POPC |
| 1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] | Avanti Polar Lipids | 880129P | Biotin-PEG-DSPE |
References
- Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. Regulation of noise in the expression of a single gene. Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).
- Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene regulation at the single-cell level. Science. 307, 1962-1965 (2005).
- Eldar, A., Elowitz, M. B. Functional roles for noise in genetic circuits. Nature. 467, 167-173 (2010).
- Hashimoto, M., et al. Noise-driven growth rate gain in clonal cellular populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3251-3256 (2016).
- Boedicker, J. Q., Vincent, M. E., Ismagilov, R. F. Microfluidic confinement of single cells of bacteria in small volumes initiates high-density behavior of quorum sensing and growth and reveals its variability. Angewandte Chemie International Edition. 48, 5908-5911 (2009).
- Christopher, M., Waters, B. L. B. Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).
- Inoue, I., Wakamoto, Y., Moriguchi, H., Okano, K., Yasuda, K. On-chip culture system for observation of isolated individual cells. Lab on a Chip. 1, 50-55 (2001).
- Wang, P., et al. Robust growth of Escherichia coli. Current Biology. 20, 1099-1103 (2010).
- Reshes, G., Vanounou, S., Fishov, I., Feingold, M. Cell shape dynamics in Escherichia coli. Biophysical Journal. 94, 251-264 (2008).
- Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Bacterial Persistence as a Phenotypic Switch. Science. 305, 1622-1625 (2004).
- Brouzes, E., et al. Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (34), 14195-14200 (2009).
- Zengler, K., et al. Cultivating the uncultured. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15681-15686 (2002).
- Eun, Y., Utada, A. S., Copeland, M. F., Takeuchi, S., Weibel, D. B. Encapsulating bacteria in agarose microparticles using microfluidics for high-throughput cell analysis and isolation. ACS Chemical Biology. 6, 260-266 (2011).
- Allen, T. M., Cullis, P. R. Liposomal drug delivery systems: From concept to clinical applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 65, 36-48 (2013).
- Szostak, J. W., Bartel, D. P., Luisi, P. L. Synthesizing life. Nature. 409, 387-390 (2001).
- Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (51), 17669-17674 (2004).
- Tan, Y. C., Hettiarachchi, K., Siu, M., Pan, Y. R., Lee, A. P. Controlled microfluidic encapsulation of cells, proteins, and microbeads in lipid vesicles. Journal of the American Chemical Society. 128 (17), 5656-5658 (2006).
- Chowdhuri, S., Cole, C. M., Devaraj, N. K. Encapsulation of Living Cells within Giant Phospholipid Liposomes Formed by the Inverse-Emulsion Technique. ChemBioChem. 17, 886-889 (2016).
- Morita, M., Katoh, K., Noda, N. Direct observation of bacterial growth in giant unilamellar vesicles: a novel tool for bacterial cultures. ChemistryOpen. 7, 845-849 (2018).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
- Hope, M. J., Bally, M. B., Webb, G., Cullis, P. R. Production of large unilamellar vesicles by a rapid extrusion procedure. Characterization of size distribution, trapped volume and ability to maintain a membrane potential. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 812, 55-65 (1985).
- Tsumoto, K., Matsuo, H., Tomita, M., Yoshimura, T. Efficient formation of giant liposomes through the gentle hydration of phosphatidylcholine films doped with sugar. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 68, 98-105 (2009).
- Li, A., Pazzi, J., Xu, M., Subramaniam, A. B. Cellulose abetted assembly and temporally decoupled loading of cargo into vesicles synthesized from functionally diverse lamellar phase forming amphiphiles. Biomacromolecules. 19, 849-859 (2018).
- Weinberger, A., et al. Gel-assisted formation of giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 105, 154-164 (2013).
- Kurokawa, C., et al. DNA cytoskeleton for stabilizing artificial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 7228-7233 (2017).
- Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane. Angewandte Chemie International Edition. 51, 3114-3118 (2012).
- Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Levy, D. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7276-7281 (2013).
- Trantidou, T., Dekker, L., Polizzi, K., Ces, O., Elani, Y. Functionalizing cell-mimetic giant vesicles with encapsulated bacterial biosensors. Interface Focus. 8, 20180024 (2018).
- Elani, Y., et al. Constructing vesicle-based artificial cells with embedded living cells as organelle-like modules. Scientific Reports. 8, 4564 (2018).
