Бактериальная культура клеток на одноклеточном уровне внутри гигантских пузырьков
Summary
Мы демонстрируем одноклеточную культуру бактерий внутри гигантских пузырьков (ГВ). ГВ, содержащие бактериальные клетки, были подготовлены методом передачи капель и были обездвижены на поддерживаемой мембране на стеклянном субстрате для прямого наблюдения за бактериальным ростом. Этот подход также может быть адаптирован к другим клеткам.
Abstract
Мы разработали метод культивирования бактериальных клеток на одноклеточном уровне внутри гигантских пузырьков (ГВ). Культура бактериальных клеток важна для понимания функции бактериальных клеток в естественной среде. Из-за технологических достижений, различные бактериальные функции клеток могут быть выявлены на одноклеточном уровне внутри ограниченного пространства. GVs представляют сферические микроразмерные отсеки, состоящие из амфифильных липидных молекул и могут содержать различные материалы, в том числе клетки. В этом исследовании, одна бактериальная клетка была инкапсулирована в 10-30 мкм GVs методом передачи капель и GVs, содержащие бактериальные клетки были обездвижены на поддерживаемой мембране на стеклянном субстрате. Наш метод полезен для наблюдения за ростом в реальном времени отдельных бактерий внутри ГВ. Мы культивировали клетки Escherichia coli (E.coli)в качестве модели внутри GV, но этот метод можно адаптировать к другим типам клеток. Наш метод может быть использован в научно-промышленных областях микробиологии, биологии, биотехнологии и синтетической биологии.
Introduction
Культура бактериальных клеток на одноклеточном уровне получила все большее внимание. Культирование бактериальных клеток на одноклеточном уровне внутри ограниченного пространства может выяснить бактериальные функции, такие как фенотипическая изменчивость1,2,3,поведениеклеток5, 6 , 7 (г. , 8 , 9, и устойчивость к антибиотикам10,11. Из-за последних достижений в области техники культуры, культура отдельных бактерий может быть достигнута внутри ограниченного пространства, например, в хорошо чип4,7,8, гель капли12,13 , и вода в масле (W / O) капля5,11. Для содействия пониманию или использованию отдельных бактериальных клеток необходимы дальнейшие технические разработки методов выращивания.
Везикулы, имитирующие мембрану биологических клеток, представляют сферические отсеки, состоящие из амфифильных молекул, и могут содержать различные материалы. Везикулы классифицируются в зависимости от размера и включают в себя небольшие пузырьки (SVs, диаметр йlt; 100 нм), большие пузырьки (LVs, lt;1 мкм), и гигантские пузырьки (GVs, SVs или LVs обыкновенно использованы как несущие снадобья из-за их сродства к биологической мембране клетки14. GVs также были использованы в качестве реакторной системы для строительства протоэлементов15 или искусственных клеток16. Инкапсуляция биологических клеток в GVs было сообщено17,18, и, таким образом, GVs показать потенциал в качестве системы клеточной культуры в сочетании с реакторной системой.
Здесь, наряду с видео экспериментальных процедур, мы описываем, как GVs могут быть использованы в качестве новых сосудов клеточной культуры19. GVs, содержащие бактерии были сделаны методом передачи капель20, а затем обездвижены на поддерживаемой мембране на крышке стекла. Мы использовали эту систему для наблюдения за ростом бактерий на одноклеточном уровне внутри ГВ в режиме реального времени.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описываем метод культивирования бактериальных клеток на одноклеточном уровне внутри ГВ. Этот простой метод включает в себя формирование ГВ, содержащих бактериальные клетки на одноклеточном уровне с помощью метода передачи капель. По сравнению с другими подходами к получению…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана ведущей инициативой для превосходных молодых исследователей (ЛИДЕР, No 16812285) от Министерства образования, культуры, спорта, науки и техники (MEXT) Японии, Грант-в-помощь для молодых ученых исследований (No 18K18157, 16K21034) от Японского общества содействия науке (JSPS) до M.M., и Грант-в-помощи от MEXT до K.K. (No 17H06417, 17H06413).
Materials
| Bactotryptone | BD Biosciences | 211705 | |
| Chloroform | Wako Pure Chemicals | 032-21921 | |
| Cover glass (18 × 18 mm) | Matsunami Glass Ind. | C018181 | thickness 0.13–0.17 mm |
| Cover glass (30 × 40 mm) | Matsunami Glass Ind. | custom-order | thickness 0.25–0.35 mm |
| Desktop centrifuge | Hi-Tech Co. | ATT101 | swing rotor type |
| Double-faced seal (10 × 10 × 1 mm) | Nitoms | T4613 | |
| Glass vial | AS ONE | 6-306-01 | Durham fermentation tube |
| Glucose | Wako Pure Chemicals | 049-31165 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX-73 | |
| Methanol | Wako Pure Chemicals | 133-16771 | |
| Microscopic heating stage system | TOKAI HIT | TP-110R-100 | |
| Mineral oil | Nacalai Tesque | 23334-85 | |
| Mini-extruder | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| Neutravidin | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
| Objective lens | Olympus | LUCPLFLN 40×/0.6 NA | |
| Polycarbonate membranes | Avanti Polar Lipids | 610005 | pore size 100 nm |
| sCMOS camera | Andor | Zyla 4.2 plus | |
| Sodium chloride | Wako Pure Chemicals | 191-01665 | |
| Sucrose | Wako Pure Chemicals | 196-00015 | |
| Ultrasonic bath | AS ONE | ASU-3D | |
| Yeast extract | BD Biosciences | 212750 | |
| 0.6 mL lidded plastic tube | Watson | 130-806C | |
| 1.5 mL lidded plastic tube | Sumitomo Bakelite Co. | MS4265-M | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocoline | Avanti Polar Lipids | 850457P | POPC |
| 1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] | Avanti Polar Lipids | 880129P | Biotin-PEG-DSPE |
References
- Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. Regulation of noise in the expression of a single gene. Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).
- Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene regulation at the single-cell level. Science. 307, 1962-1965 (2005).
- Eldar, A., Elowitz, M. B. Functional roles for noise in genetic circuits. Nature. 467, 167-173 (2010).
- Hashimoto, M., et al. Noise-driven growth rate gain in clonal cellular populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3251-3256 (2016).
- Boedicker, J. Q., Vincent, M. E., Ismagilov, R. F. Microfluidic confinement of single cells of bacteria in small volumes initiates high-density behavior of quorum sensing and growth and reveals its variability. Angewandte Chemie International Edition. 48, 5908-5911 (2009).
- Christopher, M., Waters, B. L. B. Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).
- Inoue, I., Wakamoto, Y., Moriguchi, H., Okano, K., Yasuda, K. On-chip culture system for observation of isolated individual cells. Lab on a Chip. 1, 50-55 (2001).
- Wang, P., et al. Robust growth of Escherichia coli. Current Biology. 20, 1099-1103 (2010).
- Reshes, G., Vanounou, S., Fishov, I., Feingold, M. Cell shape dynamics in Escherichia coli. Biophysical Journal. 94, 251-264 (2008).
- Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Bacterial Persistence as a Phenotypic Switch. Science. 305, 1622-1625 (2004).
- Brouzes, E., et al. Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (34), 14195-14200 (2009).
- Zengler, K., et al. Cultivating the uncultured. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15681-15686 (2002).
- Eun, Y., Utada, A. S., Copeland, M. F., Takeuchi, S., Weibel, D. B. Encapsulating bacteria in agarose microparticles using microfluidics for high-throughput cell analysis and isolation. ACS Chemical Biology. 6, 260-266 (2011).
- Allen, T. M., Cullis, P. R. Liposomal drug delivery systems: From concept to clinical applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 65, 36-48 (2013).
- Szostak, J. W., Bartel, D. P., Luisi, P. L. Synthesizing life. Nature. 409, 387-390 (2001).
- Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (51), 17669-17674 (2004).
- Tan, Y. C., Hettiarachchi, K., Siu, M., Pan, Y. R., Lee, A. P. Controlled microfluidic encapsulation of cells, proteins, and microbeads in lipid vesicles. Journal of the American Chemical Society. 128 (17), 5656-5658 (2006).
- Chowdhuri, S., Cole, C. M., Devaraj, N. K. Encapsulation of Living Cells within Giant Phospholipid Liposomes Formed by the Inverse-Emulsion Technique. ChemBioChem. 17, 886-889 (2016).
- Morita, M., Katoh, K., Noda, N. Direct observation of bacterial growth in giant unilamellar vesicles: a novel tool for bacterial cultures. ChemistryOpen. 7, 845-849 (2018).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
- Hope, M. J., Bally, M. B., Webb, G., Cullis, P. R. Production of large unilamellar vesicles by a rapid extrusion procedure. Characterization of size distribution, trapped volume and ability to maintain a membrane potential. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 812, 55-65 (1985).
- Tsumoto, K., Matsuo, H., Tomita, M., Yoshimura, T. Efficient formation of giant liposomes through the gentle hydration of phosphatidylcholine films doped with sugar. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 68, 98-105 (2009).
- Li, A., Pazzi, J., Xu, M., Subramaniam, A. B. Cellulose abetted assembly and temporally decoupled loading of cargo into vesicles synthesized from functionally diverse lamellar phase forming amphiphiles. Biomacromolecules. 19, 849-859 (2018).
- Weinberger, A., et al. Gel-assisted formation of giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 105, 154-164 (2013).
- Kurokawa, C., et al. DNA cytoskeleton for stabilizing artificial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 7228-7233 (2017).
- Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane. Angewandte Chemie International Edition. 51, 3114-3118 (2012).
- Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Levy, D. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7276-7281 (2013).
- Trantidou, T., Dekker, L., Polizzi, K., Ces, O., Elani, Y. Functionalizing cell-mimetic giant vesicles with encapsulated bacterial biosensors. Interface Focus. 8, 20180024 (2018).
- Elani, Y., et al. Constructing vesicle-based artificial cells with embedded living cells as organelle-like modules. Scientific Reports. 8, 4564 (2018).
