Cultivo celular bacteriano en el nivel de una sola célula dentro de las vesículas gigantes
Summary
Demostramos el cultivo monocelular de bacterias dentro de vesículas gigantes (GV). Los GV que contenían células bacterianas fueron preparados por el método de transferencia de gotas y fueron inmovilizados sobre una membrana apoyada sobre un sustrato de vidrio para la observación directa del crecimiento bacteriano. Este enfoque también puede ser adaptable a otras células.
Abstract
Desarrollamos un método para cultivar células bacterianas a nivel de una sola célula dentro de vesículas gigantes (GV). El cultivo celular bacteriano es importante para entender la función de las células bacterianas en el medio natural. Debido a los avances tecnológicos, varias funciones celulares bacterianas se pueden revelar a nivel de una sola célula dentro de un espacio confinado. Los GV son compartimentos esféricos de tamaño micro compuesto por moléculas de lípidos anfifílicos y pueden contener diversos materiales, incluidas las células. En este estudio, una sola célula bacteriana fue encapsulada en 10-30 m de GV por el método de transferencia de gotas y los GV que contienen células bacterianas fueron inmovilizados en una membrana apoyada en un sustrato de vidrio. Nuestro método es útil para observar el crecimiento en tiempo real de bacterias individuales dentro de los GV. Cultivamos células escherichia coli (E. coli) como modelo dentro de los GV, pero este método se puede adaptar a otros tipos de células. Nuestro método se puede utilizar en los campos científico e industrial de la microbiología, la biología, la biotecnología y la biología sintética.
Introduction
El cultivo de células bacterianas a nivel de una sola célula ha recibido cada vez más atención. Cultivar células bacterianas a nivel de una sola célula dentro de un espacio confinado puede dilucidar funciones bacterianas como la variabilidad fenotípica1,2,3,4, comportamiento celular5, 6 , 7 , 8 , 9, y resistencia a los antibióticos10,11. Debido a los recientes avances en las técnicas de cultivo, el cultivo de bacterias individuales se puede lograr dentro de un espacio confinado, como en un bien-chip4,7,8, gota de gel12,13 , y gota de agua en aceite (W/O)5,11. Para promover la comprensión o la utilización de células bacterianas individuales, se necesitan desarrollos técnicos adicionales de las técnicas de cultivo.
Las vesículas que imitan la membrana celular biológica son compartimentos esféricos que consisten en moléculas anfifílicas y pueden contener diversos materiales. Las vesículas se clasifican según el tamaño e incluyen vesículas pequeñas (SVs, diámetro < 100 nm), vesículas grandes (LV, 1 m). SVs o LV se utilizan comúnmente como portadores de drogas debido a su afinidad con la membrana celular biológica14. Los GV también se han utilizado como sistema de reactores para la construcción de protocélulas15 o células artificiales16. La encapsulación de células biológicas en GV se ha reportado17,18, y por lo tanto los GV muestran potencial como un sistema de cultivo celular cuando se combina con el sistema del reactor.
Aquí, junto con un video de procedimientos experimentales, describimos cómo los GV pueden ser utilizados como nuevos buques de cultivo celular19. Los GV que contenían bacterias fueron fabricados por el método de transferencia de gotas20 y luego fueron inmovilizados en una membrana apoyada en un vidrio de cubierta. Utilizamos este sistema para observar el crecimiento bacteriano a nivel de una sola célula dentro de los GV en tiempo real.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, describimos un método para cultivar células bacterianas a nivel de una sola célula dentro de los GV. Este método simple implica la formación de GV que contienen células bacterianas a nivel de una sola célula mediante el método de transferencia de gotas. En comparación con otros enfoques para la obtención de GV que contienen células bacterianas, este método tiene dos ventajas: (i) es fácil de desarrollar, y (ii) se requiere un pequeño volumen (2 l) de la solución de la muestra para preparar los GV. E…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por una Iniciativa Líder para Excelentes Investigadores Jóvenes (LEADER, No. 16812285) del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología (MEXT) de Japón, una Beca en Ayuda para la Investigación de Jóvenes Científicos (No 18K18157, 16K21034) de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS) a M.M., y la Beca en Ayuda de MEXT a K.K. (No 17H06417, 17H06413).
Materials
| Bactotryptone | BD Biosciences | 211705 | |
| Chloroform | Wako Pure Chemicals | 032-21921 | |
| Cover glass (18 × 18 mm) | Matsunami Glass Ind. | C018181 | thickness 0.13–0.17 mm |
| Cover glass (30 × 40 mm) | Matsunami Glass Ind. | custom-order | thickness 0.25–0.35 mm |
| Desktop centrifuge | Hi-Tech Co. | ATT101 | swing rotor type |
| Double-faced seal (10 × 10 × 1 mm) | Nitoms | T4613 | |
| Glass vial | AS ONE | 6-306-01 | Durham fermentation tube |
| Glucose | Wako Pure Chemicals | 049-31165 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX-73 | |
| Methanol | Wako Pure Chemicals | 133-16771 | |
| Microscopic heating stage system | TOKAI HIT | TP-110R-100 | |
| Mineral oil | Nacalai Tesque | 23334-85 | |
| Mini-extruder | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| Neutravidin | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
| Objective lens | Olympus | LUCPLFLN 40×/0.6 NA | |
| Polycarbonate membranes | Avanti Polar Lipids | 610005 | pore size 100 nm |
| sCMOS camera | Andor | Zyla 4.2 plus | |
| Sodium chloride | Wako Pure Chemicals | 191-01665 | |
| Sucrose | Wako Pure Chemicals | 196-00015 | |
| Ultrasonic bath | AS ONE | ASU-3D | |
| Yeast extract | BD Biosciences | 212750 | |
| 0.6 mL lidded plastic tube | Watson | 130-806C | |
| 1.5 mL lidded plastic tube | Sumitomo Bakelite Co. | MS4265-M | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocoline | Avanti Polar Lipids | 850457P | POPC |
| 1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] | Avanti Polar Lipids | 880129P | Biotin-PEG-DSPE |
References
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