ヒト誘導多能性幹細胞由来神経細胞の治療移植によるマウス脳損傷の制御された皮質衝撃モデル
Summary
このプロトコルは、オープン頭蓋骨外傷性脳損傷のマウスモデルの方法論を示し、培養ヒト誘導多能性幹細胞由来細胞を傷害部位に移植する。これらの手順からの結果の行動および組織学的検査も簡単に説明される。
Abstract
外傷性脳損傷(TBI)は、世界中の罹患率と死亡率の主要な原因です。TBIによる疾患病理学は、一次機械的侮辱から、アポトーシスおよび炎症を含む二次傷害プロセスに進行する。動物のモデリングは、傷害メカニズムを解明し、潜在的な神経保護療法を評価するための検索で貴重でした。このプロトコルは、焦点、オープンヘッドTBIの制御された皮質衝撃(CCI)モデルについて説明します。具体的には、軽度の一方的皮質損傷を産生するためのパラメータが記載されている。CCIの行動結果は、両側感覚運動統合の粘着テープ除去試験を用いて分析される。TBI病理の実験療法に関しては、このプロトコルはまた、培養細胞を脳に移植するプロセスを示す。ヒト誘導多能性幹細胞(hiPSC)に由来する神経細胞培養物は、ヒトTBI患者において優れた機能回復を示す可能性のために選択された。宿主マウス脳組織におけるhiPSCの慢性生存は、修飾されたDAB免疫組織化学プロセスを用いて検出される。
Introduction
外傷性脳損傷(TBI)は、頭部への打撃または物体または爆風波からの直接的な損傷による間接的な機械的力(回転加速度/減速または逆クーデター)による脳への後天的損傷の一般的な用語である。TBIは、世界の死亡者の約9%の原因であると推定されており、年間5,000万例の症例が1,2例と推定されています。米国疾病管理予防センターの2017年の報告書によると、2013年には、米国のTBIによる合計280万人の病院訪問と死亡がありました。多くの穏やかなTBAは毎年報告されていません。深刻なTBIは、認知、運動機能、および生活の全体的な質の生涯の障害につながることができます。軽度のTBI、特に反復的なスポーツ関連のTBIの結果は、最近、彼らの陰湿な健康影響4、5のために高く評価されています。
前臨床モデリングは、TBIの新しい機械的洞察と潜在的な修復療法を開発する上で重要な要素です。TBIの制御された皮質衝撃(CCI)モデルは皮質への機械的挫傷のオープンヘッドモデルである。衝撃パラメータは、軽度から重度の6までのCCI傷害を生成するために変更することができます。CCIの傷害は、TBIの他の閉じた頭部モデルと見られるように、拡散ではなく焦点である。CCIは、反対方皮質が内部比較器として機能するように、一方的な傷害を誘発するために行うことができる。このプロトコルは、一次身体感覚および運動領域を包含する皮質の一部に対する軽度のCCIの特性を示す。この皮質領域は、多数の行動検査が傷害による欠陥7を検出できる感覚運動行動への関与のために選ばれた。TBIの治療介入による行動改善も検出できる。
TBIの特徴は、負傷した地域における広範な神経機能障害である。負傷したニューロンは細胞死を受け、ニューロンネットワーク接続は8,9.TBIは内因性幹細胞の募集を妨害し、さらに下流行動の赤字10,11を引き起こした。 神経幹細胞と幹細胞由来細胞の移植は、傷ついた脳の機能を回復させる可能性として探求されている。損傷した神経回路を回復させる可能性に加えて、移植された細胞は、TBI12からの神経生存および機能回復を促進するパラクリン効果を発揮する。様々な細胞型が前臨床移植され、神経疾患13、14、15のモデルにおけるそれらの修復可能性を評価した。誘導多能性幹細胞技術16の最近の普及は、実験的使用のための多数のヒト幹細胞株の開発を促進している。hiPSC由来細胞による前臨床試験は、ヒト疾患に対する特定の細胞株の潜在的な治療有効性を特徴付ける重要な第一歩である。本研究室では、外傷性脳損傷からの回復を支援する移植可能な細胞を追求するために、hiPSCを神経型17に区別するためのプロトコルを開発した。
このプロトコルの実験は、一方的なCCIを使用して、成体マウスの左身体感覚および運動皮質にTBIを誘導する。軽度のCCI損傷は、機能回復に対するhiPSC由来神経細胞移植の影響を追跡するために使用される右前足の持続的な機能的欠損をもたらす。このプロトコルにおけるフォアポーセンサ運動試験は、Bouetおよび同僚18によって確立された方法論から適応され、フレミングと同僚19によって以前に実証された。 このプロトコルは、実験的脳損傷、hiPS細胞の治療移植、および実験結果測定の行動および組織学的分析を行うための完全なワークフローを概説する。
Protocol
このプロトコルに記載されているすべての実験は、ユニフォームサービス大学動物ケアおよび使用委員会によってレビューされ、承認されました。 1. 頭蓋切除術と制御された皮質影響 制御された皮質衝撃装置および外科用品の準備。 創傷灌漑用の無菌生理生理生殖水の0.5 mLで1 mLのスリップチップシリンジをロードします。25Gの針を注射器に取り付けて灌?…
Representative Results
頭蓋切除手術は、実験的な脳損傷と治療細胞移植を容易にする:脳損傷およびその後の細胞移植療法の制御された皮質衝撃モデルは、上の頭蓋骨の慎重な除去を必要とする。頭蓋切除術は、目的の脳領域への操作を可能にするために、頭蓋骨の任意の後部面で行われてもよい。図1の図は、原発性身体感覚および運動皮質を明らかにするために、直径5mmの頭蓋…
Discussion
実験再生療法の試験モデルシステムとしての軽度CCI
CCIモデルは皮質への機械的損傷の後の組織機能不全のメカニズムを調査するための貴重な用具である。傷害の変数の力性はこのモデルの魅力的な特徴である。衝撃のZ深度を変化させる、速度、または所望時間は、研究者が所望する傷害の重症度を、研究者10、25によって増減させることができる。<su…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、神経科学再生医療センター(CNRM、助成番号G170244014)からの助成金によって支援されました。我々は、接着剤除去パイロット研究におけるマヒマ・デューワンとクララ・セルブレードの支援に感謝します。クライスレーヌ・ラドムスキーは予備的な脳損傷と細胞移植手術を行った。USU CNRM前臨床研究コアラボのアマンダ・フーとローラ・タッカーは、それぞれ動物の手術と行動検査に関する貴重なアドバイスを提供しました。
Materials
| 1 ml syringes | Becton Dickinson (BD) | 309659 | |
| 1.7 ml flip top test tubes | Denville | C2170 | |
| 10 microliter syringe | Hamilton | 7635-01 | |
| 25G Precision Glide syringe needles | Becton Dickinson (BD) | 305122 | |
| 70% ethanol | Product of choice; varies by region | ||
| acetaminophen oral suspension | Tylenol (Children's) | Dilute to 1 mg/ml in water | |
| anesthetic vaporizer | Vetland | 521-11-22 | |
| animal handling cloth | Purchase from department store | ||
| Betadine | Purdue Products | NDC-67618-151-32 | |
| compressed oxygen | Product of choice; varies by region | ||
| cyclosporine A | Sigma-Aldrich | 30024-100mg | |
| DAB staining kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418-500ml | |
| DMEM | Invitrogen (ThermoFisher) | A14430-01 | |
| donkey anti-mouse IgG antibody, HRP conjugated | Jackson ImmunoResearch | 715-035-151 | |
| electrical tape | 3M Corporation | Purchase from department store | |
| fine tweezers | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| glass capillary pipettes, 1 mm OD, 0.58 mm ID | World Precision Instruments | 1B100F-3 | |
| High Speed Rotary Micromotor Kit | Foredom Electric Co. | K.1070 – K.107018 | |
| Ideal Micro Drill Burr Set Of 5 | Cell Point Scientific | 60-1000 | |
| Impact One Stereotaxic Impactor for CCI | Leica Biosystems | 39463920 | |
| isoflurane | Baxter | NDC-10019-360-60 | |
| lab bench timers | Fisher Scientific | 14-649-17 | |
| Micropipette puller | MicroData Instruments, Inc. | PMP-102 | Any puller will suffice |
| Microscope cover slips | Fisherbrand | 12-545-E | |
| Microscope slide mounting medium | Product of choice | ||
| mirror | Purchase from department store | ||
| mouse anti-human nuclear antigen antibody | Millipore | MAB1281 | |
| Mouse on Mouse blocking kit | Vector Laboratories | BMK-2202 | |
| needle holder hemostat | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| ophthalmic ointment | Falcon Pharmaceuticals | NDC-61314-631-36 | |
| ophthalmic spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| plastic box | Purchase from department store | ||
| plastic cylinder | Purchase from department store | ||
| QSI motorized syringe pump | Stoelting | 53311 | |
| Removable needle compression fitting | Hamilton | 55750-01 | |
| small rodent stereotaxic frame | Stoelting | 51925 | |
| small scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| StemPro Accutase | Invitrogen (ThermoFisher) | A1110501 | |
| Sterile alcohol prep pads | Fisherbrand | 06-669-62 | |
| sterile cotton swabs/Kendall Q-tips | Tyco Healthcare | 540500 | |
| Sterile saline | Hospira | NDC-0409-1966-07 | |
| Stopwatches (2) | Fisher Scientific | 06-662-56 | |
| Superfrost Plus Gold microscope slides | Fisherbrand | 15-188-48 | |
| sutures – 5.0 silk with curved needle | Oasis | MV-682 |
References
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Citer Cet Article
Furmanski, O., Nieves, M. D., Doughty, M. L. Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells. J. Vis. Exp. (149), e59561, doi:10.3791/59561 (2019).