Denne protokollen demonstrerer metoder for en mus modell av åpen-Skull traumatisk hjerneskade og transplantasjon av kultivert menneskelig indusert pluripotent stilk cellen-avledet celler inn i skaden området. Atferds-og histologic tester av resultatene fra disse prosedyrene er også beskrevet i korte trekk.
Traumatisk hjerneskade (TBI) er en ledende årsak til sykelighet og dødelighet over hele verden. Sykdom patologi på grunn av TBI utvikler seg fra den primære mekaniske fornærmelse til sekundære skader prosesser, inkludert apoptose og betennelser. Animal modellering har vært verdifullt i søket til å løse skade mekanismer og evaluere potensielle nervecellene terapier. Denne protokollen beskriver kontrollerte kortikale Impact (CCI) modell av fokal, åpen hodet TBI. Nærmere bestemt beskrives parametere for å produsere en mild ensidig kortikale skade. Behavioral konsekvensene av CCI er analysert ved hjelp av teip fjerning test av bilaterale Sensorimotor integrering. Når det gjelder eksperimentell terapi for TBI patologi, illustrerer denne protokollen også en prosess for å transplantere kultivert celler inn i hjernen. Neural cellekulturer avledet fra humant indusert Pluripotent stamceller (hiPSCs) ble valgt for sitt potensial til å vise overlegen funksjonell restaurering i menneskelige TBI pasienter. Kronisk overlevelse av hiPSCs i verts musen hjernevevet oppdages ved hjelp av en modifisert DAB immunhistokjemiske prosess.
Traumatisk hjerneskade (TBI) er en generell betegnelse for ervervet skade på hjernen på grunn av enten indirekte mekaniske krefter (rotasjons akselerasjon/retardasjon eller Contra-kupp) fra slag mot hodet eller direkte skade fra gjenstander eller blast bølger. TBI er anslått å være årsaken til om lag 9% av verdensomspennende dødsfall og observert i anslagsvis 50 000 000 tilfeller per år1,2. En 2017 rapport fra Centers for sykdom kontroll og forebygging anslått at i 2013, var det totalt 2 800 000 sykehus besøk og dødsfall på grunn av TBI i USA3. Mange mildere TBIs gå urapporterte hvert år. Alvorlig TBI kan føre til livslang svekkelse av kognisjon, motorisk funksjon, og generell livskvalitet. Konsekvensene av mild TBI, spesielt repeterende sport-relaterte TBI, har nylig blitt verdsatt for deres lumske helseeffekter4,5.
Prekliniske modellering er en viktig komponent i utviklingen av ny mekanistisk innsikt og potensiell oppkvikkende terapi for TBI. Den kontrollerte kortikale virkningen (CCI) modell av TBI er en åpen-Head modell av mekanisk kontusjon skade på cortex. Virkningen parametrene kan endres for å produsere CCI skader som spenner fra mild til alvorlig6. CCI skader er fokal i stedet for diffuse, som sett med andre lukkede hodet modeller av TBI. CCI kan utføres for å indusere en ensidig skade, slik at kontralateral cortex kan tjene som en intern komparator. Denne protokollen demonstrerer egenskapene til en mild CCI til en del av cortex som omfatter primære somatosensory og motor regioner. Dette kortikale området ble valgt for sitt engasjement i Sensorimotor atferd som mange atferds tester kan oppdage skade-indusert underskudd7. Atferds forbedringer på grunn av terapeutiske intervensjoner for TBI kan oppdages, også.
Et kjennetegn på TBI er utbredt neural dysfunksjon i den skadde regionen. Skadde neurons gjennomgår celle død, og neuronal nettverkstilkobling er forstyrret8,9. TBI forstyrrer rekrutteringen av endogene stamceller, noe som fører til videre nedstrøms atferd underskudd10,11. Transplantasjon av nevrale stamceller og stilk cellen-avledet celler har blitt utforsket som en mulighet til å gjenopprette funksjon i den skadde hjernen. I tillegg til potensialet for å gjenopprette skadede nevrale kretser, transplanterte celler utøve paracrine effekter som fremmer neuronal overlevelse og funksjonell utvinning fra TBI12. En rekke celletyper har blitt transplantert preklinisk å evaluere deres styrkende potensial i modeller av nevrologiske lidelser13,14,15. Den nylige popularisering av indusert pluripotent stamcelleteknologi16 har muliggjort utviklingen av en rekke menneskelige stilk cellen linjer for eksperimentell bruk. Prekliniske testing med hiPSC-avledede celler er et viktig første skritt for å karakteriserer en gitt cellelinje potensielle terapeutiske effekt mot menneskelige sykdommer. Dette laboratoriet har utviklet protokoller for å skille hiPSCs til neural fenotyper17 i jakten på transplantable celler for å hjelpe utvinning fra traumatisk hjerneskade.
Eksperimenter i denne protokollen bruker en ensidig CCI for å indusere TBI til venstre somatosensory og motor cortex hos voksne mus. En mild CCI skade resulterer i en vedvarende funksjonell underskudd i riktig fire som brukes til å spore virkningene av hiPSC-avledet nevrale celle engraftment på funksjonell utvinning. Fire Sensorimotor testing i denne protokollen ble tilpasset fra metodikken etablert av Bouet og kolleger18 og demonstrerte tidligere av Fleming og kolleger19. Denne protokollen skisserer en komplett arbeidsflyt for å utføre en eksperimentell hjerneskade, terapeutisk transplantasjon av hiPS celler, og atferds-og histologic analyse av eksperimentelle utfallet tiltak.
Mild CCI som et modell system for testing av eksperimentell regenererende behandling
CCI-modellen er et verdifullt verktøy for å undersøke mekanismer for vevs dysfunksjon etter mekanisk skade på cortex. Justeringsevne av skaden parametrene er en attraktiv ansiktstrekk av denne modell. Endring av Z dybden av virkningen, hastigheten, eller holde tid kan øke eller redusere alvorlighetsgraden av skaden som ønsket av etterforsker10,25. Den mi…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av en bevilgning fra senter for nevrovitenskap og regenererende medisin (CNRM, Grant nummer G170244014). Vi setter pris på hjelp av Mahima Dewan og Clara Selbrede i lim fjerning pilotstudier. Kryslaine Radomski utført foreløpige hjerneskade og celle transplantasjon operasjoner. Amanda Fu og Laura Tucker av USU CNRM prekliniske Studies kjerne laboratorium gitt verdifulle råd om dyr operasjoner og atferds testing, henholdsvis.
1 ml syringes | Becton Dickinson (BD) | 309659 | |
1.7 ml flip top test tubes | Denville | C2170 | |
10 microliter syringe | Hamilton | 7635-01 | |
25G Precision Glide syringe needles | Becton Dickinson (BD) | 305122 | |
70% ethanol | Product of choice; varies by region | ||
acetaminophen oral suspension | Tylenol (Children's) | Dilute to 1 mg/ml in water | |
anesthetic vaporizer | Vetland | 521-11-22 | |
animal handling cloth | Purchase from department store | ||
Betadine | Purdue Products | NDC-67618-151-32 | |
compressed oxygen | Product of choice; varies by region | ||
cyclosporine A | Sigma-Aldrich | 30024-100mg | |
DAB staining kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418-500ml | |
DMEM | Invitrogen (ThermoFisher) | A14430-01 | |
donkey anti-mouse IgG antibody, HRP conjugated | Jackson ImmunoResearch | 715-035-151 | |
electrical tape | 3M Corporation | Purchase from department store | |
fine tweezers | Fine Science Tools | 11254-20 | |
forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
glass capillary pipettes, 1 mm OD, 0.58 mm ID | World Precision Instruments | 1B100F-3 | |
High Speed Rotary Micromotor Kit | Foredom Electric Co. | K.1070 – K.107018 | |
Ideal Micro Drill Burr Set Of 5 | Cell Point Scientific | 60-1000 | |
Impact One Stereotaxic Impactor for CCI | Leica Biosystems | 39463920 | |
isoflurane | Baxter | NDC-10019-360-60 | |
lab bench timers | Fisher Scientific | 14-649-17 | |
Micropipette puller | MicroData Instruments, Inc. | PMP-102 | Any puller will suffice |
Microscope cover slips | Fisherbrand | 12-545-E | |
Microscope slide mounting medium | Product of choice | ||
mirror | Purchase from department store | ||
mouse anti-human nuclear antigen antibody | Millipore | MAB1281 | |
Mouse on Mouse blocking kit | Vector Laboratories | BMK-2202 | |
needle holder hemostat | Fine Science Tools | 12002-12 | |
ophthalmic ointment | Falcon Pharmaceuticals | NDC-61314-631-36 | |
ophthalmic spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | |
plastic box | Purchase from department store | ||
plastic cylinder | Purchase from department store | ||
QSI motorized syringe pump | Stoelting | 53311 | |
Removable needle compression fitting | Hamilton | 55750-01 | |
small rodent stereotaxic frame | Stoelting | 51925 | |
small scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
StemPro Accutase | Invitrogen (ThermoFisher) | A1110501 | |
Sterile alcohol prep pads | Fisherbrand | 06-669-62 | |
sterile cotton swabs/Kendall Q-tips | Tyco Healthcare | 540500 | |
Sterile saline | Hospira | NDC-0409-1966-07 | |
Stopwatches (2) | Fisher Scientific | 06-662-56 | |
Superfrost Plus Gold microscope slides | Fisherbrand | 15-188-48 | |
sutures – 5.0 silk with curved needle | Oasis | MV-682 |