Her presenterer vi metoder for å forbedre sekundær bakteriell lungebetennelse studier ved å gi en ikke-invasiv rute drypping inn i den nedre luftveiene etterfulgt av patogen utvinning og transkripsjon analyse. Disse prosedyrene er reproduserbar og kan utføres uten spesialisert utstyr som kanyler, lede ledninger eller fiberoptiske kabler.
Sekundær bakteriell pneumonias følgende influensa infeksjoner konsekvent rang innenfor de ti viktigste årsakene til dødsfall i USA. Hittil har murine modeller av co-smitte vært det viktigste verktøyet utviklet for å utforske patologi både primære og sekundære infeksjoner. Til tross for utbredelsen av denne modellen, er betydelige uoverensstemmelser med hensyn til drypping prosedyrer, dose volumer og efficacies utbredt blant studiene. Videre har dette arbeidet i stor grad vært ufullstendig i adressering hvordan patogen kan være direkte påvirke sykdomsprogresjon post-smitte. Heri gir vi en presis metode for patogen levering, utvinning og analyse som skal brukes i murine modeller av sekundær bakteriell lungebetennelse. Vi viser at intratrakeal drypping muliggjør en effektiv og nøyaktig levering av kontrollerte volumer direkte og jevnt inn i de nedre luftveiene. Lungene kan være excised å utvinne og kvantifisere patogen byrde. Etter fjerning av de infiserte lungene, beskriver vi en metode for å trekke ut høy kvalitet patogen RNA for påfølgende transcriptional analyse. Denne prosedyren drar nytte av å være en ikke-kirurgisk metode for levering uten bruk av spesialisert laboratorieutstyr og gir en reproduserbar strategi for å undersøke patogen bidrag til sekundær bakteriell lungebetennelse.
Sekundær bakteriell lungebetennelse etter influensa infeksjon er en ledende dødsårsaken i USA og et aktivt område av forskning1,2. Til tross for Tallrike studier med murine modeller av sekundær bakteriell lungebetennelse, inkonsekvenser om patogen drypping og avhør forbli3,4,5. I tillegg, mens mange tidligere tiltak har fokusert på immunmodulerende effekter av influensa som fører til en økt susceptibly til sekundær bakteriell infeksjon, nyere data antyder virulens regulering av bakteriell patogen er en likeverdig bidragsyter mot etablering av sykdom6,7,8,9. Disse nye data nødvendig en mer presis metode for å utforske sekundære bakteriell lungebetennelse i murine modeller av co-infeksjon som letter etterforskning av patogen respons.
Unik for influensa co-infeksjon modeller, vert organismer er forsettlig immunsupprimerte av en primær influensa infeksjon før administrasjon av sekundær bakteriell agent. For å best gjenskape sykdommen patogenesen observert i menneskelige verter, er det viktig at patogen belastningen av både primære og sekundære agenter styres for å observere den enkelte og Kombinatorisk effekter av hver smittsomme agent. Vanligvis har luftveisinfeksjoner i mus blitt etablert gjennom en intranasal administrasjon3,4,5,6,10. Ettersom denne ruten er kjent for å være teknisk enkel og kan være hensiktsmessig i noen enkelt agent infeksjon programmer, er det uegnet for co-smitte modeller, som drypping prosedyrer, dose volumer, og effekten er svært variabel i Publisert litteratur3,4,5,6.
For å få en mer fullstendig forståelse av sekundær bakteriell lungebetennelse patogenesen, bidrag av både verten og patogen må vurderes. For dette formål har vi utviklet en grei og reproduserbar tilnærming for gjenvinning av levedyktige bakterier og patogen RNA fra infiserte lunger. Denne metoden bruker en forenklet, ikke-invasiv intratrakeal drypping prosedyre etterfulgt av påfølgende isolering av bakteriell RNA. Intratrakeal drypping prosedyren beskrevet heri ligner på tidligere beskrevne metoder og er ikke begrenset til patogen levering11,12,13. Bruk av denne spesielle prosedyren fordeler av å være lave kostnader og krever ikke bruk av spesialisert utstyr som kanyler, lede ledninger, eller fiberoptisk kabel; Videre, fordi denne prosedyren er ikke-invasiv det sikrer minimal belastning på murine, minimerer en inflammatorisk respons fra inoculation mekanikere, og gir en effektiv levering rute for smitte av flere. Kort sagt, isoflurane anesthetized mus er suspendert fra fortenner. Tang brukes til å forsiktig gripe tungen etterfulgt av innsetting av en forhåndslastet bøyd, Butt-tippet, 21-gauge nål inn i luftrøret og levering av patogen belastning. Validering av denne prosedyren er demonstrert av visuell bekreftelse av fargestoff jevnt fordelt i lunge-rommet og gjenvinning av bakteriell belastning. Vi viser hvordan du kan gjenopprette levedyktig Staphylococcus aureus (S. aureus) fra infiserte lungene og beskrive en reproduserbar metode for å ISOLERE høy kvalitet patogen RNA.
Bruk av denne modellen gir en svært effektiv og reproduserbar metode for å studere sekundære bakterielle infeksjoner. Evnen til å tett kontrollere levering av patogen inokulum muliggjør mer presise observasjoner av den enkelte og Kombinatorisk effekter av hver patogen. Ineffektivitet i den mer vanlige intranasal drypping ruten har trolig bidratt til avvik i dose volumer og konsentrasjoner som finnes i litteraturen. Det er rimelig at mangelen på en presis murine system for å studere sekundær bakteriell lungebetennelse har forsinket funn identifisere bakterielle spesifikke tiltak som bidrar til alvorlighetsgraden av lunge infeksjoner. Utvikle en reproduserbar modell for å studere virulens uttrykk under sekundære bakterielle infeksjoner kan føre til identifisering av vaksine eller narkotika mål å bøte disse infeksjonene.
Den intratrakeal drypping trinnet er avgjørende for å kunne etablere en nedre luftveisinfeksjon og noen Down-stream analyse av patogener. Når du lærer denne teknikken, kan det være nyttig å øve ved hjelp av et fargestoff (som beskrevet i metodene) før administrering av smittsomme materialer. Ved hjelp av et fargestoff gir mulighet for direkte visualisering av inokulum inn i luftveiene. En vanlig feil som kan oppstå er innsetting av stump-nålen i spiserøret i stedet for luftrøret. Dette vil resultere i levering av inokulum i magen i stedet for lungene. For å rette opp denne feilen, vinkel nålen lenger vekk fra kroppen og passerer den ned i luftrøret. Når den er mastret, er denne fremgangsmåten svært effektiv og kan brukes til å utføre eksperimenter med et stort antall mus. Ved å arbeide i grupper for å bedøve mus, kan intratrakeal drypping fullføres på cirka 30 sekunder per mus. I tillegg kan fjerning av lungene være ferdig i 2 til 3 minutter per mus.
Gjenvinning av levedyktig og ren bakteriell RNA fra infisert vev er avgjørende for transkripsjon analyse. RNases er allestedsnærværende og kan raskt ødelegge et eksperiment15. Noen metoder inkluderer bruk av RNase-hemmere; Vi har imidlertid funnet at frysing prøven ved-80 ° c i RLT-ß-mercaptoethanol eller umiddelbart behandle prøven for RNA-isolasjon ved hjelp av alle RNase frie rør og reagenser er effektive for å redusere RNase forurensning. I tillegg anbefaler vi at maksimalt seks prøver renses på en gang. Inkludert mer enn seks prøver kan føre til langvarig latencies mellom protokoll trinn som kan kulminere i RNA-degradering. Når renset, bør forsiktighet også tas for å unngå unødvendige fryse-tine sykluser. Hvis flere analyser blir utført på en prøve, anbefales det derfor at aliquoting renset RNA for lagring ved-80 ° c.
I tillegg til teknikkene gjennomgått her, kan denne metoden suppleres ved å utføre bronkial alveolære tømming før fjerning og homogenation av lungene16. Dette kan oppnås ved tømming av hele nedre luftveier eller ved å bruke Sutur tråden til å begrense en forgrening arm av bronkial treet etterfulgt av tømming gjennom de resterende gren. Ofte fører dette til en reduksjon i utvinningen av patogen lasten, men gir en prøve hvorpå informasjon som melkesyre dehydrogenase aktivitet, cellulær befolkning identitet, og cytokin profiler kan fås16. Sammen disse dataene kan danne en mer fullstendig forståelse av verten-patogen interaksjoner oppstår under videregående bakteriell lungebetennelse.
Mens metodene diskutert har vært innenfor rammen av sekundær bakteriell lungebetennelse, de er egnet til å utvides til enhver murine modell av lavere luftveisinfeksjon; spesielt, de som ville ha nytte av strengt kontrollert levering og gjenoppretting av den installerte inokulum. Videre, som mange andre infeksjons ruter, kan intratrakeal drypping benyttes i ikke-smittsomme anvendelser, slik som administrering av legemiddel-og miljø forbindelser12.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil takke Nicole Meissner, MD/Ph.D., Montana State University, for hennes hjelp til å etablere den intratrakeal drypping metoden. Dette arbeidet ble støttet av US National Institutes of Health (Grants NIH-1R56AI135039-01A1, GM110732, R21AI128295, U54GM115371), samt midler fra Montana University system Research Initiative (51040-MUSRI2015-03) og Montana State University Landbruk Experiment Station.
Lysing Matrix B | MP Biomedicals | 6911100 | Referred to in text as "0.1 mm silica beads" |
21-gauge blunt needle | SAI | B21-150 | 1.5" is recommended. |
RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | DNase used in the accompanying text. |
FastPrep-24 Classic Instrument | MP Biomedicals | 116004500 | FastPrep FP120 is no longer available. Referred to in text as "Bead Beater" |
TaqMan AIV-Matrix Reagents | Applied Biosystems | 4405543 | Influenza A M-segment qRT-PCR kit. |
Intubation Stand | Kent Scientific | ETI-MES-01 | Referred to in text as "intubation platform." Intubation platform used in the accompanying video was made in house. |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | RNA purification kit; contains RNeasy columns, Buffer RLT, Buffer RW1, and Buffer RPE |
QIAamp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52904 | Viral RNA purification kit. |
Tissue Grinders | Thermo Fisher Scientific | 02-542-08 | |
2-Mercaptoethanol (β-Mercaptoethanol) | Calbiochem | UN2966 |