在这里,我们提出一个协议,旨在使用化学遗传学工具操纵移植到早期产后小鼠皮层的皮质内祖细胞的活动。
神经元发育受环境和遗传因素的复杂组合调节。评估每个组分的相对贡献是一项复杂的任务,在β-氨基丁酸(GABA)的内质内神经质(CIs)的发展方面尤其困难。CIs是大脑皮层中的主要抑制神经元,它们通过调节单个金字塔神经元的活动以及神经元集合的振荡行为,在神经元网络中起关键作用。它们产生于瞬态胚胎结构(中生和胆小龙-MGE和CGE),很难在子宫电穿孔方法中有效地瞄准使用。内神经元祖在正常胚胎发育期间迁移长距离,然后集成到皮质回路中。这种分散和集成到一个正在发展的网络的非凡能力可以通过将胚胎内神经元前体移植到产后早期宿主皮质中来劫持。在这里,我们提出了一个协议,允许使用焦点外体电穿孔对胚胎内代孕激素进行基因改造。这些工程的内神经元前体然后移植到产后早期宿主皮质,在那里他们将成熟成容易识别的CIs。该协议允许使用多种基因编码工具,或调节内神经祖细胞中特定基因表达的能力,以便研究遗传或环境变量对成熟和集成了 C。
神经元网络的功能依赖于兴奋性投影神经元和抑制性内神经元的平衡补充的存在。虽然皮质内神经元(CIs)只占哺乳动物皮质中所有神经元的20%,但其数量或功能上的缺陷被认为在神经发育障碍1、2的发病机制中起着关键作用。对CI开发的研究具有挑战性,因为CI是在难以获取的瞬态胚胎结构中生成的,它们在到达宫内并发育成熟的解剖学和生理发育之前,会遵循一个漫长的切向迁移属性3。众所周知,基因和环境机制可以调节CI的发展,但事实证明,研究多种因素的相对贡献是很困难的。
在从5、6分离后代后,利用体外培养系统获得了CI开发的许多见解。这些方法的一大优点是有可能标记和基因修改分离的祖细胞,并详细跟踪其分化,以检测细胞自主变化。然而,这些方法无法提供有关发展中内神经元与活动网络之间相互作用的信息。我们已经通过将改性前体移植到产后早期皮层,调整了这些规程。从胚胎神经显质分离的内神经元祖在移植到皮层7、8时能够存活、分散和集成到宿主网络。这种方法已用于降低遗传小鼠模型中癫痫发作的严重程度,并已被提出作为一种可能的新疗法,治疗不同的神经发育障碍9,10。以前的协议描述了在移植11之前用病毒载体转导这些前体的过程。我们在这里描述的协议也允许对内神经元进行基因改造,但不需要创建病毒载体,只需要质粒DNA,这大大提高了它的灵活性。一些研究报告说,在子宫电穿孔中成功地在牛神经质(CGE)12中基因修饰内神经元祖细胞,但这种方法已经证明很难繁殖。
在具有代表性的结果部分,我们说明了这种方法的使用,以表达设计师药物(DREADDs13)在移植的CI中完全激活的设计师受体,我们在最近的出版物14中使用了这种方法。我们表示hM3D(Gq),一种基于人类胆碱能受体CHRM3的工程受体,除非它结合其特定的配体氯扎平-N-氧化物(CNO),否则不会影响神经元功能。CNO 管理选择性地触发 hM3D(Gq) 表达细胞的激活。我们用这种方法表明,细胞自主和瞬态去极化足以防止在发育14过程中CIs凋亡。结合不同的基因编码工具,该协议具有向上或向下调节基因表达的潜力,并在不同内神经元分化阶段可视化或操纵细胞活动。
在这里,我们描述了一种广泛可获取的方法,用于基因修饰 CI 前体的活性,以研究内在活性对 CI 成熟的影响,和/或活动调节 CI 对集成皮质的组装/功能的影响电路。
过去,包括我们的在内的几个实验室在子宫电穿孔实验中进行了基因改造投影神经元6。然而,在子宫电穿孔到包括CI祖子的结旋显性是非常困难的,由于电传导路径问题。为了解决这个问题,少数实验室正在进行超声波引导注射,然后是电穿孔,这是一项要求很高的技术,需要昂贵的设备。该协议为这些方法提供了一种替代方法,大多数科学界都可以采用这些方法。
该协议最具挑战性的方面之一是,当通常执行型板分析时,将宿主皮层中存活的细胞数量最大化到成熟阶段(非常依赖于实验设计,但通常早于 P17)。调查人员应注意三个关键步骤:(1)电穿孔效率。通过确保DNA质粒的纯度,可以最大化这一点。此过程只应使用高质量的 DNA 质粒(A260/A280比率为 1.9-2.0)。我们采用氯化氯化物纯化法获得如此高质量的DNA制剂。另一个关键因素是推动兴趣基因表达的促进因素。研究发现,由鸡b-肌剂促进剂组成的pCAGGs载体功能非常强大,能显著提高电穿孔效率。(2) 起始供体胚胎的数量。务必确保同一阶段的大量(12-16)胚胎被电镀。如果更多的实验者一起进行胚胎解剖和切片,这个数字可以增加,因为必须尽快获得胚胎皮质切片,电镀并转移到培养箱。(3) 必须确保在每个小狗中注入大量的细胞,以确保移植细胞存活到成熟阶段的几率很高。此外,这将大大提高成功移植的可能性,因为低密度细胞制剂将导致细胞与介质的不均匀混合,这将在移植的大脑中产生显著的变异性15.
此处描述的协议是为调查活动在细胞自主方式调节 CI 生存中的作用而定制的。P14-P17执行CNO注射的时间窗口是根据公布的数据特别选择的,这表明移植的CI祖细胞死亡高峰发生在这一时期16。因此,这个时间框架或CNO注射的频率可能不适用于其他细胞类型或大脑区域,研究者应根据特定的实验目的调整这些参数。最后,此处描述的颅内注射CIs的方法仅适用于P0-P5小狗(取决于鼠标线背景)。原则上,任何超过P5的注射都需要变薄或取出头骨15。
该协议的主要优点之一是能够使用新的基因编码工具,在 CI 集成到一个不断发展的网络时,在不同分化阶段可视化或操纵它们的活动。随着新的基因编码电压和钙传感器以及新的化学遗传学和光遗传学工具的发现步伐,该协议允许研究人员在释放到质粒储存库(如Addgene)的几周内使用它们。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了ERC启动赠款(282047)、威康信托调查员奖(095589/Z/11/Z)、FP7 EC DESIRE赠款和为JB颁发的李斯特研究所奖的支持。V.P.实验室的工作得到BBSRC(BB/L022974/1)、英国医学研究委员会(MRC)和弗朗西斯·克里克研究所(接受MRC、英国癌症研究部和韦康信托基金的资助)的支持。作为基金会支持希腊研究倡议的一部分,从斯塔夫罗斯·尼亚科斯基金会向B.S.R.C.”亚历山大·弗莱明”提供资助,使M.D.实验室的研究成为可能。
Medium/Supplements | |||
B-27 | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 175040-044 | |
DMEM/F12 | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 21331-020 | |
DNAse | SIGMA | DN15-100MG | |
FBS | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 10270-098 | |
100x Glutamine | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 35050-061 | |
L15 | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 11415-049 | |
MEM alpha, GlutaMAX | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 32561-029 | |
Neurobasal medium | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 21103-049 | Neuron basic medium |
100x P/S | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 15140-122 | |
Equipment | |||
Electroporator | BTX | ECM 830 generator | |
Injector for acute slice electroporation | Eppendorf | FemtoJet Microinjector | |
Injector for cell transplantation (I) | Visual Sonics | Vevo Injector System | |
Injector for cell transplantation (II) | WPI | NANOLITER2010 | |
Magnetic Stand | WPI | M10L Magnetic Stand | |
Kite Manual Micromanipulator | WPI | KITE-M3-R | |
Platinum Elecrode (I) | Protech International Inc. | CUY-700-1 | |
Platinum Elecrode (II) | Protech International Inc. | CUY-700-2 | |
Steel Base Plate | WPI | 5479 | |
Vibratome | Leica | VT1200S | |
Other Material | |||
Glass capillaries for electroporation | VWR | 1B100-4 | |
Glass capillaries for cell transplantation | Visual Sonics | provided by Visual Sonics | |
Nuclepore 8 µm whatman membrane | SLS | 110414 | |
Organ tissue culture dishes | BD Biosciences (Falcon) | 353037 |