यहाँ हम एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत, cortical interneuron संतति की गतिविधि में हेरफेर करने के लिए chemogenetic उपकरण का उपयोग करने के लिए डिज़ाइन किया गया जल्दी प्रसव के बाद चूहों के प्रांतस्था में प्रत्यारोपित.
तंत्रिका विकास पर्यावरण और आनुवंशिक कारकों का एक जटिल संयोजन द्वारा विनियमित है. प्रत्येक घटक के सापेक्ष योगदान का आकलन एक जटिल कार्य है, जो विशेष रूप से मुश्किल है के विकास के संबंध में है $-aminobutyric एसिड (GABA) ergic cortical interneurons (CIs). CIs सेरेब्रल प्रांतस्था में मुख्य निरोधात्मक न्यूरॉन्स हैं, और वे न्यूरॉन नेटवर्क में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, व्यक्तिगत पिरामिड न्यूरॉन्स की दोनों गतिविधि को विनियमित करके, साथ ही न्यूरॉन पहनावा के दोलनात्मक व्यवहार. वे क्षणिक भ्रूण संरचनाओं में उत्पन्न कर रहे हैं (मध्य और पुच्छ गुच्छिक eminences – MGE और CGE) कि बहुत मुश्किल कुशलता से utero electroporation दृष्टिकोण में उपयोग कर लक्ष्य कर रहे हैं. Interneuron संतति सामान्य भ्रूण विकास के दौरान लंबी दूरी की दूरी विस्थापित, इससे पहले कि वे cortical सर्किट में एकीकृत. यह उल्लेखनीय करने के लिए फैलाने और एक विकासशील नेटवर्क में एकीकृत करने की क्षमता भ्रूण interneuron अग्रदूतों जल्दी प्रसव के बाद मेजबान cortices में प्रत्यारोपण द्वारा अपहरण कर लिया जा सकता है. यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल है कि भ्रूण interneuron संतति के आनुवंशिक संशोधन फोकल पूर्व vivo electroporation का उपयोग कर की अनुमति देता है प्रस्तुत करते हैं. ये इंजीनियर interneuron अग्रदूतों तो जल्दी प्रसव के बाद मेजबान cortices में प्रत्यारोपित कर रहे हैं, जहां वे आसानी से पहचाने जाने योग्य CIs में परिपक्व हो जाएगा. इस प्रोटोकॉल कई आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग उपकरण के उपयोग की अनुमति देता है, या interneuron संतति में विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति को विनियमित करने की क्षमता, क्रम में परिपक्वता पर या तो आनुवंशिक या पर्यावरणचर के प्रभाव की जांच करने के लिए और CIs का एकीकरण.
न्यूरॉन नेटवर्क के समारोह उत्तेजक प्रक्षेपण न्यूरॉन्स और निरोधात्मक interneurons के एक संतुलित पूरक के अस्तित्व में निर्भर करता है. हालांकि cortical interneurons (सीसी) केवल स्तनधारी cortices में सभी न्यूरॉन्स के 20% का प्रतिनिधित्व करते हैं, उनकी संख्या या समारोह में घाटे neurodevelopmental विकारों के रोगजनन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए सोचा जाता है1,2. सीआई विकास का अध्ययन चुनौतीपूर्ण है क्योंकि सीआई क्षणिक भ्रूण संरचनाओं कि उपयोग करने के लिए मुश्किल कर रहे हैं में उत्पन्न कर रहे हैं, और वे एक लंबे स्पर्शरेखीय प्रवास का पालन करने से पहले वे pallium तक पहुँचने और उनके परिपक्व शारीरिक और शारीरिक विकास गुण3| दोनों आनुवंशिक और पर्यावरण तंत्र ज्ञात हैं कि सीआई विकास4को विनियमित, लेकिन यह कई कारकों के रिश्तेदार योगदान का अध्ययन करने के लिए मुश्किल साबित हो गया है.
सीआई विकास में कई अंतर्दृष्टि प्राप्त की गई थी , जो गंडकीय एमिनेंस5,6से संतानों के अलगाव के बाद इन विट्रो कल्चर सिस्टम का उपयोग करके प्राप्त की गई थीं . इन तरीकों के महान लाभ में से एक लेबल और आनुवंशिक रूप से अलग संतानों को संशोधित करने और विस्तार से उनके भेदभाव का पालन करने की क्षमता है, सेल-स्वायत्त परिवर्तन का पता लगाने के लिए. हालांकि, इन तरीकों interneurons और एक सक्रिय नेटवर्क के विकास के बीच बातचीत के बारे में जानकारी की पेशकश करने में असमर्थ हैं. हम इन प्रोटोकॉल अनुकूलित किया है, जल्दी प्रसव के बाद प्रांतस्था में संशोधित अग्रदूतों के प्रत्यारोपण द्वारा. भ्रूणीय गुच्छिका eminences से अलग Interneuron संतति जीवित रहने के लिए, फैलाने और प्रांतस्था7में प्रत्यारोपण पर मेजबान नेटवर्क में एकीकृत करने में सक्षम हैं,8. इस विधि का उपयोग आनुवंशिक माउस मॉडलों में मिरगी के दौरे की गंभीरता को कम करने के लिए किया गया है और विभिन्न न्यूरोडेवलपमेंटल विकारों9,10के लिए एक संभावित नई चिकित्सा के रूप में प्रस्तावित किया गया है . पिछले प्रोटोकॉल में प्रत्यारोपण11से पहले वायरल सदिशों के साथ इन अग्रदूतों को ट्रांसड्यूस करने की प्रक्रिया का वर्णन किया गया है. प्रोटोकॉल हम यहाँ का वर्णन भी interneurons के आनुवंशिक संशोधन की अनुमति देता है, लेकिन एक वायरल वेक्टर के निर्माण की आवश्यकता नहीं है, केवल प्लाज्मिड डीएनए की आवश्यकता होती है, जो बहुत इसके लचीलेपन बढ़ जाती है. कुछ अध्ययनों से आनुवंशिक रूप से काडडल गुच्छिका eminences में interneuron संतति को संशोधित करने के लिए utero electroporation में उपयोग करने में सफलता की सूचना दी (CGE)12, लेकिन इस विधि को पुन: पेश करने के लिए बहुत मुश्किल साबित हो गया है.
प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में, हम डिजाइनर रिसेप्टर्स विशेष रूप से डिजाइनर दवाओं द्वारा सक्रिय व्यक्त करने के लिए इस विधि के उपयोग को वर्णन (DREADDs13) प्रतिरोपित CIs में, एक विधि हम हाल ही में एक प्रकाशन14में इस्तेमाल किया. हम HM3D (जीक्यू), मानव कोलीनर्जिक रिसेप्टर CHRM3 पर आधारित एक इंजीनियर रिसेप्टर व्यक्त किया, जो न्यूरॉन समारोह को प्रभावित नहीं करता है जब तक कि यह अपने विशिष्ट लिगन्ड clozapine-एन-ऑक्साइड (CNO) बांधता है. CNO प्रशासन चुनिंदा hM3D (GQ) कोशिकाओं को व्यक्त करने के सक्रियण से चलाता है. हमने इस विधि का उपयोग यह दिखाने के लिए किया कि सेल स्वायत्त और क्षणिक विध्रुवण विकास14के दौरान CIs के apoptosis को रोकने के लिए पर्याप्त है . विभिन्न आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग उपकरणों के साथ संयुक्त, इस प्रोटोकॉल अप करने की क्षमता है या नीचे जीन अभिव्यक्ति को विनियमित, और कल्पना या interneuron भेदभाव के विभिन्न चरणों के दौरान सेल गतिविधि में हेरफेर.
यहाँ हम सीआई परिपक्वता पर आंतरिक गतिविधि के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए सीआई अग्रदूतों की गतिविधि आनुवंशिक रूप से संशोधित करने के लिए एक व्यापक रूप से सुलभ पद्धति का वर्णन, और / सर्किट.
अतीत में, हमारे सहित कई प्रयोगशालाओं, आनुवंशिक रूप से प्रक्षेपण न्यूरॉन्स6को संशोधित करने के क्रम में utero इलेक्ट्रोपोर्शन प्रयोगों में प्रदर्शन किया था। हालांकि, यूटेरो इलेक्ट्रोपोरोन में गुच्छिकाीय एमिनेंस में जिसमें सीआई संतति शामिल है, विद्युत चालन पथ समस्याओं के कारण बहुत मुश्किल है। आदेश में इस समस्या को हल करने के लिए, प्रयोगशालाओं की एक छोटी संख्या अल्ट्रासाउंड निर्देशित इंजेक्शन इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद प्रदर्शन कर रहे हैं, जो एक मांग तकनीक है कि महंगा उपकरण की आवश्यकता है. इस प्रोटोकॉल इन तरीकों जो वैज्ञानिक समुदाय के बहुमत के लिए सुलभ है के लिए एक विकल्प प्रदान करता है.
इस प्रोटोकॉल का सबसे चुनौतीपूर्ण पहलू में से एक कोशिकाओं है कि मेजबान प्रांतस्था में जीवित रहने के लिए चरणों परिपक्व करने के लिए की संख्या को अधिकतम करने के लिए है, जब phenotypic विश्लेषण आमतौर पर किया जाता है (बहुत प्रयोग डिजाइन पर निर्भर है, लेकिन आम तौर पर P17 से पुराने). वहाँ तीन महत्वपूर्ण कदम है कि अन्वेषक ध्यान देना चाहिए रहे हैं: (1) विद्युत पोर्शन की दक्षता. यह डीएनए प्लाज्मिड की शुद्धता सुनिश्चित करके अधिकतम किया जा सकता है। केवल उच्च गुणवत्ता वाले डीएनए प्लाज्मिड (एकA 260/A280 अनुपात 1.9-2.0) इस प्रक्रिया के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. हम सीजियम क्लोराइड डीएनए शुद्धि को रोजगार द्वारा इस तरह के उच्च गुणवत्ता वाले डीएनए तैयारी प्राप्त करते हैं। एक अन्य महत्वपूर्ण कारक प्रमोटर है कि ब्याज के जीन की अभिव्यक्ति ड्राइव है. हमने पाया है कि pCAGGs वेक्टर, जो चिकन बी-actin प्रमोटर के होते हैं, अत्यंत शक्तिशाली है और नाटकीय रूप से विद्युत उत्पादन दक्षता में वृद्धि कर सकते हैं. (2) शुरू दाता भ्रूण की संख्या. यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि एक ही चरण के भ्रूणों की एक बड़ी संख्या (12-16) विद्युतीकृत हो। इस संख्या को बढ़ाया जा सकता है, यदि अधिक प्रयोगकर्ता भ्रूण विच्छेदन और एक साथ अनुभागकर प्रदर्शन कर रहे हैं, क्योंकि यह महत्वपूर्ण है कि भ्रूण cortical स्लाइस प्राप्त कर रहे हैं, electroporated और जितनी जल्दी हो सके इनक्यूबेटर को स्थानांतरित. (3) यह सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या परिपक्व चरणों तक प्रतिरोपित सेल अस्तित्व के एक उच्च मौका सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक पिल्ला में इंजेक्शन रहे हैं बनाने के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, यह नाटकीय रूप से सफल प्रत्यारोपण की संभावना में सुधार होगा के बाद से कम घनत्व सेल की तैयारी मध्यम के साथ कोशिकाओं के असमान मिश्रण में परिणाम होगा, जो प्रत्यारोपित दिमाग में महत्वपूर्ण परिवर्तनशीलता का उत्पादन होगा15 .
यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल एक सेल-स्वायत्त तरीके से सीआई अस्तित्व को विनियमित करने में गतिविधि की भूमिका की जांच के लिए तैयार किया गया था। CNO इंजेक्शन प्रदर्शन के लिए P14-P17 समय खिड़की विशेष रूप से प्रकाशित डेटा के अनुसार चुना गया था, जो बताते हैं कि प्रतिरोपित सीआई संतति ‘सेल मौत की चोटी इस अवधि के दौरान होता है16. इसलिए, इस समय सीमा या CNO इंजेक्शन की आवृत्ति अन्य सेल प्रकार या मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए सच नहीं पकड़ सकता है, और अन्वेषक विशिष्ट प्रयोगात्मक प्रयोजनों के अनुसार इन मापदंडों को समायोजित करना चाहिए. अंत में, CIs के इंट्राक्रैनियल इंजेक्शन के लिए यहाँ वर्णित पद्धति केवल P0-P5 पिल्ले के लिए संभव है (माउस लाइन पृष्ठभूमि पर भी निर्भर करता है)। सिद्धांत रूप में, P5 पर किसी भी इंजेक्शन thinning या खोपड़ी15को हटाने की आवश्यकता होगी.
इस प्रोटोकॉल के प्रमुख लाभों में से एक वे एक विकासशील नेटवर्क में एकीकृत के रूप में भेदभाव के विभिन्न चरणों के दौरान CIs की गतिविधि कल्पना या हेरफेर करने के लिए नए आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग उपकरण का उपयोग करने की क्षमता है. नई आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग वोल्टेज और कैल्शियम सेंसर की खोज की गति के साथ, साथ ही नए chemogenetic और optogenetic उपकरण, इस प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं उन्हें प्लाज्मिड खजाने में रिलीज के सप्ताह के भीतर उपयोग करने की अनुमति देता है, जैसे Addgene.
The authors have nothing to disclose.
यह काम एक ईआरसी स्टार्टर अनुदान (282047), एक वेलकम ट्रस्ट अन्वेषक पुरस्कार (095589/$/11/]), एक FP7 ईसी DESIRE अनुदान, और जेबी के लिए एक लिस्टर संस्थान पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया था। वी.पी. की प्रयोगशाला में काम BBSRC (BB/L022974/1), ब्रिटेन चिकित्सा अनुसंधान परिषद (एमआरसी), और फ्रांसिस क्रिक संस्थान (जो एमआरसी, कैंसर अनुसंधान ब्रिटेन, और वेलकम ट्रस्ट) से धन प्राप्त करता है द्वारा समर्थित है। एमडी प्रयोगशाला में अनुसंधान के लिए B.S.R.C. “Alexander फ्लेमिंग”, ग्रीक अनुसंधान का समर्थन करने के लिए फाउंडेशन की पहल के भाग के रूप में Stavros Niarchos फाउंडेशन से अनुदान के माध्यम से संभव बनाया गया था.
Medium/Supplements | |||
B-27 | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 175040-044 | |
DMEM/F12 | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 21331-020 | |
DNAse | SIGMA | DN15-100MG | |
FBS | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 10270-098 | |
100x Glutamine | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 35050-061 | |
L15 | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 11415-049 | |
MEM alpha, GlutaMAX | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 32561-029 | |
Neurobasal medium | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 21103-049 | Neuron basic medium |
100x P/S | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 15140-122 | |
Equipment | |||
Electroporator | BTX | ECM 830 generator | |
Injector for acute slice electroporation | Eppendorf | FemtoJet Microinjector | |
Injector for cell transplantation (I) | Visual Sonics | Vevo Injector System | |
Injector for cell transplantation (II) | WPI | NANOLITER2010 | |
Magnetic Stand | WPI | M10L Magnetic Stand | |
Kite Manual Micromanipulator | WPI | KITE-M3-R | |
Platinum Elecrode (I) | Protech International Inc. | CUY-700-1 | |
Platinum Elecrode (II) | Protech International Inc. | CUY-700-2 | |
Steel Base Plate | WPI | 5479 | |
Vibratome | Leica | VT1200S | |
Other Material | |||
Glass capillaries for electroporation | VWR | 1B100-4 | |
Glass capillaries for cell transplantation | Visual Sonics | provided by Visual Sonics | |
Nuclepore 8 µm whatman membrane | SLS | 110414 | |
Organ tissue culture dishes | BD Biosciences (Falcon) | 353037 |