यहां, एक मात्रात्मक वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन आधारित प्रोटोकॉल के निर्धारण के लिए प्रस्तुत किया जाता है देशी माइक्रो-आरएनए सामग्री लिपोप्रोटीन कणों की (निरपेक्ष/रिश्तेदार) । इसके अलावा, माइक्रो-आरएनए स्तर को बढ़ाने के लिए एक विधि, साथ ही लिपोप्रोटीन कणों के सेलुलर तेज दर का निर्धारण करने के लिए एक विधि का प्रदर्शन किया है ।
लिपोप्रोटीन के कण प्रबल रूप से लिपिड और कोलेस्ट्रोल के ट्रांसपोर्टर होते हैं । इसके अलावा, वे noncoding microRNA (मिरना) की किस्में की छोटी मात्रा में होते हैं. सामान्य तौर पर मीरना मेसेंजर-आरएनए (एमआरएनए) के साथ बातचीत के कारण प्रोटीन एक्सप्रेशन प्रोफाइल को बदल देते हैं । इस प्रकार, लेपोप्रोटीन कणों के सापेक्ष और निरपेक्ष मिरना सामग्री के ज्ञान सेलुलर कण तेज के जैविक प्रभाव का अनुमान लगाने के लिए आवश्यक है । यहां, एक मात्रात्मक वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qpcr) आधारित प्रोटोकॉल लिपोप्रोटीन कणों की निरपेक्ष mirna सामग्री का निर्धारण करने के लिए प्रस्तुत किया जाता है-उदाहरण के लिए देशी और mirna-समृद्ध लिपोप्रोटीन कणों के लिए दिखाया । रिश्तेदार मिरना सामग्री multiwell microfluidic सरणी कार्ड का उपयोग कर मात्रा निर्धारित है । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल वैज्ञानिकों सेलुलर मिरना का अनुमान है और इस प्रकार, लिपोप्रोटीन कण तेज दर की अनुमति देता है । सेलुलर miRNA स्तर की एक महत्वपूर्ण वृद्धि नमूदार है जब उच्च घनत्व लेपोप्रोटीन (HDL) कृत्रिम रूप से मिरना के साथ लोड कणों का उपयोग कर, जबकि देशी HDL कणों के साथ ऊष्मायन कोई महत्वपूर्ण उनके बजाय कम miRNA सामग्री की वजह से प्रभाव पैदावार । इसके विपरीत, कम घनत्व वाले लिपोप्रोटीन (एलडीएल) कणों के सेलुलर तेज-न तो देशी मिरना के साथ और न ही कृत्रिम रूप से इसके साथ भरी हुई-सेलुलर मिरना स्तर में परिवर्तन नहीं किया ।
लिपोप्रोटीन के कण उभयलिस्टीय लिपिड्स और कोलेस्ट्रॉल के एक मोनोलेयर से बने होते हैं जो कोलेस्ट्राल एस्टर और ट्राइग्लिसराइड वसा के एक कोर को enclosing करते हैं । पूरे कण झिल्ली एंबेडेड apolipoproteins है, जो कण की जैविक कार्यशीलता को परिभाषित द्वारा स्थिर है । लिपोप्रोटीन कणों को उनके संबंधित वर्धमान घनत्व के अनुसार प्रतिष्ठित किया जा सकता है और इस प्रकार घटते हुए आकार, नामत बहुत कम घनत्व वाले लिपोप्रोटीन (वीएलडीएल), मध्यवर्ती-घनत्व लिपोप्रोटीन (आईडीएल), एलडीएल और एचडीएल कणों के रूप में । खून में पानी अघुलनशील घटकों के परिवहन के बावजूद, यह प्रदर्शन किया गया है कि एचडीएल कणों मिरना1,2के noncoding किस्में ले । माइक्रो-rnas कम (आमतौर पर दो दर्जन न्यूकोटाइड) आरएनए किस्में, जो intracellularly पूरक mrna किस्में नीचा और, जिससे कुछ प्रोटीन की अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल बदलने के एक वर्ग हैं3,4,5, ६। इसके अलावा, miRNA प्रोफ़ाइल के परिवर्तन रोगों की एक किस्म में पाया गया है और, इस प्रकार, प्रोफ़ाइल निदान और रोग का निदान के लिए एक biomarker के रूप में लागू होता है. लिपोप्रोटीन कणों के माध्यम से कोशिकाओं के बीच mirnas के extracellular परिवहन अंतराकोशिक mrna स्तर मॉडुलन के लिए एक अतिरिक्त तंत्र के रूप में सेवा कर सकते हैं । मात्रात्मक रूप से जैविक प्रभाव का अनुमान लगाने के लिए, लिपोप्रोटीन कणों के निरपेक्ष और सापेक्ष mirna सामग्री के बारे में ज्ञान की जरूरत है ।
मात्रात्मक रीयल-टाइम पीसीआर इस जानकारी को प्राप्त करने के लिए एक उपयुक्त और अपेक्षाकृत त्वरित विधि है । इसलिए, सापेक्ष परिमाणीकरण (rq) मूल्य की गणना की जा सकती है, और विभिन्न नमूनों और लिपोप्रोटीन भागों के बीच सापेक्ष अंतर बहुमूल्य हैं । Multiwell microfluidic सरणी कार्ड एक तेज और आसान करने के लिए उपयोग करने के लिए संबंधित उपस्थिति निर्धारित विधि (RQ मूल्य के लिए equates) एक नमूना में miRNAs के हैं । Multiwell microfluidic सरणी कार्ड एक microfluidic डिवाइस में एम्बेडेड व्यक्तिगत qPCR प्रतिक्रियाओं के लिए ९६ या ३८४ व्यक्तिगत प्रतिक्रिया कक्षों से मिलकर. प्रत्येक कक्ष में आवश्यक हाइड्रोलिसिस जांच और विशिष्ट qpcr प्राइमर्स एक व्यक्ति मिरना के लिए शामिल हैं । लाभ मानकीकरण, एक सरल कार्यप्रवाह, और pipetting चरणों की एक कम संख्या के कारण एक कम हैंडलिंग समय कर रहे हैं. इसके अलावा, आवश्यक नमूना मात्रा कम है । सापेक्ष मात्रा के विपरीत, निरपेक्ष miRNA सामग्री मिरना strands की ज्ञात निरपेक्ष संख्या के मानक curves के साथ qPCR नमूना परिणामों की तुलना की आवश्यकता है । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि, उनके अपेक्षाकृत कम mirna सामग्री के कारण, मानक और, इसके अलावा, यहां तक कि एकल अणु संवेदनशील इमेजिंग तकनीक व्यवहार्य नहीं हैं-मिरना के साथ लिपोप्रोटीन कणों के कृत्रिम संवर्धन सेलुलर अध्ययन करने के लिए अपरिहार्य है लाइपोप्रोटीन पार्टिकल इंटरेक्शन और मिन्ना ट्रांसफर । इस के बारे में, बाद में relipidation7 के साथ पीछा एचडीएल कण के delipidation की अनुमति देता है और इस प्रकार, मिरना strands के साथ संवर्धन । इसी प्रकार, एमआईएनए के साथ एलडीएल कणों का संवर्धन एपीओबी-१०० प्रोटीन के हाइड्रोफोटोसिटी के कारण व्यवहार्य नहीं है, जो एलडीएल कण का मुख्य संघटक है । हालांकि, ध्रुवीय विलायक डाइमेथिल सल्फॉनाइड (dmso), जो लिपिड झिल्ली घुसना करने में सक्षम है के अलावा, ldl कणों कृत्रिम रूप से अच्छी तरह से mirna किस्में के साथ भरी हुई हो सकता है ।
उच्च-गति परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एचएस-AFM) सुक्ष्ममापी स्थानिक और subद्वितीया लौकिक संकल्प8की पेशकश जैविक नमूनों के लक्षण वर्णन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है । इसलिए, यह संशोधित लिपोप्रोटीन कणों की गुणवत्ता नियंत्रण के लिए एक अच्छी तरह से अनुकूल तकनीक है, क्योंकि देशी/पुनर्गठित/लेबल वाले लिपोप्रोटीन कणों को निकट-शरीरक्रियात्मक वातावरण के अंतर्गत प्रत्यारोपित किया जा सकता है ।
यहां, एक qpcr आधारित प्रोटोकॉल कदम दर कदम प्रस्तुत है लिपोप्रोटीन कणों और सेल नमूनों, जो सेलुलर लिपोप्रोटीन कण तेज की कीमत का एक अनुमान की अनुमति देता है की निरपेक्ष/ इसके अलावा, मिरना के साथ लिपोप्रोटीन कणों के संवर्धन के लिए एक विधि का प्रदर्शन किया है । इस विधि को लिपोप्रोटीन सामग्री के सामान्य हेरफेर के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और इसलिए यह औषध वितरण के लक्ष्य के रूप में लिपोप्रोटीन कणों की प्रयोज्यता को प्रदशत करता है ।
यहां, लिपोप्रोटीन कण मानव रक्त से भागों के अलगाव और उनके व्यक्तिगत mirna सामग्री के निर्धारण कदम दर कदम वर्णित है । यह एक rnase मुक्त वातावरण में काम करने के लिए महत्वपूर्ण है, जबकि अलग हैंडलिंग और संश्लेषित मिरना-कण-एम्बेडेड मिरना जाहिर है एंजाइमी गिरावट से आश्रय है । के रूप में mirna/कण अनुपात देशी लिपोप्रोटीन कणों के बजाय कम है, mirna के साथ कृत्रिम संवर्धन कोशिकाओं के holo कण तेज अध्ययन करने के लिए आवश्यक है । इस प्रकार, HDL कणों का पुनर्गठन के रूप में पहले वर्णित7 mirna किस्में शामिल करने के लिए संशोधित किया गया है । इसके अलावा, इस प्रक्रिया के दौरान लिपिड और प्रोटीन अंश के पृथक्करण वैज्ञानिकों लिपिड की जांच करने के लिए अनुमति देता है-और लिपोप्रोटीन कण के प्रोटीन से जुड़े घटक19। इसी तरह, LDL कणों की लेबलिंग प्रक्रिया अनुकूलित है । गौर करने वाली बात यह है कि शुक्रवारों के एक प्राकृतिक स्टेबलाइजर-मिरना/कण अनुपात को प्रभावित नहीं किया । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि सिद्धांत रूप में, विधि एक लिपोप्रोटीन कण के भीतर मिरना से अंय पदार्थों के infolding अनुमति देता है । बेशक, एचडीएल (व्यास: 5-12 एनएम) और एलडीएल कणों (व्यास: 18-25 एनएम) के समग्र आकार के आधार पर पदार्थ के भौतिक आकार के संबंध में एक सीमा है ।
पुनर्गठित/लेबल लिपोप्रोटीन कणों के गुणवत्ता नियंत्रण से संबंधित, एच एस afm एक लागू करने के लिए एक कण के स्तर पर एचडीएल/ EM की तुलना में, यह कम तैयारी के समय और निकट शारीरिक स्थितियों (गीला, कमरे के तापमान) के लिए अनुमति देता है ।
अपनी अंतर्निहित संवेदनशीलता और प्रवर्धन के कारण, qPCR विकल्प की विधि को कम मिररना सांद्रता का पता लगाने है । वैकल्पिक रूप से, एकल अणु संवेदी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, जो भी व्यक्तिगत अणुओं का पता लगाने में सक्षम है, की कम सांद्रता के कारण उपयुक्त नहीं होगा, उदाहरण के लिए, fluorescently प्रति कण मिन्ना किस्में लेबल. इस प्रकार, मिरना किस्में प्रति नेटिव लिपोप्रोटीन कण का अनुपात 10-8पाया गया है । कृत्रिम संवर्धन १०,००० के एक कारक है, जो सेलुलर लिपोप्रोटीन तेज दर के अनुमान की सुविधा (कोई महत्वपूर्ण अंतर देशी लिपोप्रोटीन कणों 19का उपयोग कर पता चला है) के अनुपात से बढ़ जाती है । क्यूपीसीआर की उच्च संवेदनशीलता ऊष्मायन समय और मिरना/कण अनुपात के बाद मिरना किस्में की संख्या को मापने के द्वारा इस तेज दर का निर्धारण करने के लिए संभव बनाता है । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि परिकलित मान सेल्युलर अवक्रमण और मिरना की रिहाई पर ध्यान नहीं देता है और, इस प्रकार, लिपोप्रोटीन कण तेज अनुपात के लिए एक कम से कम एक सीमा का प्रतिनिधित्व करता है ।
भविष्य में, विधि दवाओं (विशेष रूप से भी lipophilic वाले) कोशिकाओं में हस्तांतरण और intracellular एकाग्रता के लिए उनके जैविक प्रभाव सहसंबंधी करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है (लिपोप्रोटीन कणों के तेज दर के द्वारा निर्धारित) ।
The authors have nothing to disclose.
यह काम ऑस्ट्रिया के विज्ञान कोष परियोजना P29110-B21 द्वारा समर्थित किया गया था, “Hochschulzur Förderung डर Wissenschaft” परियोजना एच-3065/2011, यूरोपीय क्षेत्रीय विकास के लिए कोष (EFRE, IWB2020), ऊपरी के संघीय राज्य ऑस्ट्रिया, और “भूमि ओमो Basisfinanzierung” ।
Ultracentrifuge | Beckman | Optima L-100 XP | Lipoprotein isolation |
Ultracentrifuge rotor | Beckman | TI 55.2 | Lipoprotein isolation |
Vacutainer (EDTA) | Becton Dickinson | 366643 | Lipoprotein isolation |
Kaliumbromid | Sigma Aldrich | 2110 | Lipoprotein isolation |
Ultracentrifuge tubes | Beckman | 342414 | Lipoprotein isolation |
Ultracentrifuge tube sealer | Beckman | 342428 | Lipoprotein isolation |
Sodiumchlorid | Carl Roth GmbH | P029.2 | Lipoprotein isolation |
EDTA | Fisher Scientific | D/0650/50 | Lipoprotein isolation |
Dialysis tubes, MWCO 12 – 14k | Spectra | 132700 | Lipoprotein isolation |
synthetic miRNA | microSynth | – | synthetic miRNA |
TRIS buffer pH 7 | Ambion | AM9850G | synthetic miRNA |
TRIS buffer pH 8 | Ambion | AM9855G | synthetic miRNA |
sterile tubes | Carl Roth GmbH | ENE8.1 | synthetic miRNA |
Photometer | Eppendorf | Eppendorf Biophotometer | Bradford assay |
Cuvette | Carl Roth GmbH | XK20 | Bradford assay |
Coomassie G-250 Stain | BioRad GmbH | 161-0786 | Bradford assay |
Sodiumchlorid | Carl Roth GmbH | 3957.1 | Delipitation |
EDTA | Fluka Analytical | 03690-100ML | Delipitation |
TRIS buffer pH 8.0 | Ambion | AM9855G | Delipitation |
Ethanol 100% | AustrAlco | Ethanol Absolut 99.9% | Delipitation |
Diethyl ether | Carl Roth GmbH | 3942.1 | Delipitation |
Centrifuge | Thermo Scientific | Multifuge X3R | Delipitation |
Chloroform | Carl Roth GmbH | 3313.1 | Reconstitution |
Methanol | Carl Roth GmbH | 4627.1 | Reconstitution |
Phosphatidylcholine | Sigma Aldrich GmbH | P3556-25mg | Reconstitution |
Cholesterol oleate | Sigma Aldrich GmbH | C-9253-250mg | Reconstitution |
cholesterol | Sigma Aldrich GmbH | C8667-500mg | Reconstitution |
glass tubes | Carl Roth GmbH | K226.1 | Reconstitution |
spermine | Sigma Aldrich GmbH | S3256-1G | Reconstitution |
Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer comfort | Reconstitution |
Sodium deoxycholate | Sigma Aldrich GmbH | 3097-25G | Reconstitution |
Magnetic stir bar | Carl Roth GmbH | 0955.2 | Reconstitution |
100µL micropipettes | Carl Roth GmbH | A762.1 | Reconstitution |
PBS | Carl Roth GmbH | 9143.2 | Dialysis |
Amberlite XAD-2 beads | Sigma Aldrich GmbH | 10357 | Dialysis |
Slide-A-Lyzer casette (cut-off 20 kDa) | Thermo Scientific | 66003 | Dialysis |
Syringe | Braun | 9161406V | Dialysis |
Syringe needle | Braun | 465 76 83 | Dialysis |
EGTA | Carl Roth GmbH | 3054.2 | Labeling of LDL particles |
DMSO | life technologies | D12345 | Labeling of LDL particles |
Atomic Force Microscope | RIBM | SS-NEX | Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles |
Muscovite Mica (V-1 Grade) | Christine Gröpl | G250-1/V1 | Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles |
AFM Cantilever | Nanoworld | USC-F1.2-k0.15 | Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles |
Gwyddion 2.49 | Czech Metrology Institute | http://gwyddion.net | Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles |
Chamber slides, Nunc Lab-Tek | VWR | 734-2122 | Cell culture |
HBSS | Carl Roth GmbH | 9117.1 | Cell culture |
Cell counter | Omni Life Science GmbH | Casy | Cell culture |
miRNeasy Mini Kit | QIAGEN | 217004 | miRNA extraction |
Centrifuge | Eppendorf | 5415R | miRNA extraction |
20G needle | Braun | Sterican 465 75 19 | miRNA extraction |
5ml syringe | Becton Dickinson | 309050 | miRNA extraction |
PCR cabinet | Esco | PCR-3A1 | Reverse Transcription |
TaqMan Reverse Transcription Kit | Thermo Scientific | 4366596 | Reverse Transcription |
Rnase-free water | Carl Roth GmbH | T143 | Reverse Transcription |
0.2 ml tubes | Brand | 781305 | Reverse Transcription |
Centrifuge | Carl Roth GmbH | Microcentrifuge AL | Reverse Transcription |
Thermocycler | Sensoquest | Labcycler | Reverse Transcription |
TaqMan Primer | Thermo Scientific | – | qPCR |
iTaq Universal probe supermix | BioRad GmbH | 1725131 | qPCR |
PCR machine | Corbett | Rotor-Gene RG-6000 | qPCR |
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4366596 | TaqMan Array |
Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 | Applied Biosystems | 4399966 | TaqMan Array |
TaqMan PreAmp Master Mix | Applied Biosystems | 4391128 | TaqMan Array |
Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 | Applied Biosystems | 4399933 | TaqMan Array |
TaqMan Universal Master Mix II, no UNG | Applied Biosystems | 4440040 | TaqMan Array |
TaqMan Advanced miRNA Human A Cards | Applied Biosystems | A31805 | TaqMan Array |
Nuclease-free water | Thermo Scientific | R0581 | TaqMan Array |
MgCl2 (25mM) | Thermo Scientific | R0971 | TaqMan Array |
TE, pH 8.0 | Invitrogen | AM9849 | TaqMan Array |
7900HT Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4351405 | TaqMan Array |
TaqMan Array Card Sealer | Applied Biosystems | – | TaqMan Array |