Localizzazione delle proteine di SUMO-modificate utilizzando proteine di cattura di Sumo fluorescente
Summary
Il SUMO è una proteina modificatoria di tipo ubiquitina, essenziale e altamente conservata. In questo protocollo stiamo descrivendo l’uso di una proteina di SUMO-trapping ricombinante tollerante allo stress (kmUTAG) per visualizzare i coniugati SUMO nativi e senza tag e la loro localizzazione in una varietà di tipi di cellule.
Abstract
Qui presentiamo un nuovo metodo per studiare la sumoilazione delle proteine e la loro localizzazione subcellulare nelle cellule dei mammiferi e negli ovociti nematodi. Questo metodo utilizza un frammento di proteina di SUMO-trapping modificato ricombinante, kmUTAG, derivato dalla proteasi di SUMO Ulp1 del lievito in erba tollerante allo stress Kluyveromyces marxianus. Abbiamo adattato le proprietà del kmUTAG allo scopo di studiare la sumoilazione in una varietà di sistemi di modelli senza l’uso di anticorpi. Per lo studio di SUMO, KmUTAG ha diversi vantaggi rispetto agli approcci basati su anticorpi. Questo reagente a tolleranza di SUMO è prodotto recombinantly, riconosce le isoforme di SUMO native di molte specie e, a differenza degli anticorpi disponibili in commercio, Mostra una ridotta affinità per il SUMO libero e non coniugato. I risultati rappresentativi qui riportati includono la localizzazione dei coniugati SUMO nelle cellule di coltura tissutale dei mammiferi e negli ovociti nematodi.
Introduction
Lo scopo di questo metodo è quello di facilitare lo studio e l’analisi delle proteine coniugate con SUMO utilizzando la proteina ricombinante SUMO-trapping UTAG ( tagULP Domain). Come descritto di seguito, UTAG può essere utilizzato al posto di altri reagenti e approcci per purificare, rilevare e visualizzare le proteine di SUMO modificate. A seconda delle condizioni di crescita, le cellule possono contenere centinaia o migliaia di proteine che vengono modificate con le catene SUMO o SUMO (per la revisione vedere Kerscher et al. 20061 e kerscher 20162). Questo rappresenta una notevole difficoltà per le analisi funzionali di specifiche proteine SUMO-modificate, soprattutto perché solo una frazione di un particolare bersaglio di SUMOilazione è effettivamente modificato3. Oltre ai loro ruoli nei processi cellulari essenziali come la regolazione trascrizionale, l’omeostasi proteica, la risposta allo stress cellulare e il rimodellamento della cromatina durante la mitosi e la meiosi; Ora è diventato sufficientemente chiaro che il Sumo, le proteine modificate dal sumo e i componenti del pathway di Sumo hanno anche un potenziale come biomarcatori per patologie come il cancro e le patologie neurodegenerative4,5,6 ,7. Ciò sottolinea la necessità di strumenti robusti, affidabili e prontamente disponibili e di approcci innovativi per la rilevazione e l’analisi funzionale delle proteine di SUMO modificate in una varietà di cellule e campioni.
In molti sistemi, gli anticorpi specifici per Sumo sono i reagenti di scelta per le analisi di rilevazione, isolamento e funzionale delle proteine di Sumo-modificate8,9. Tuttavia, alcuni anticorpi specifici per SUMO disponibili in commercio sono costosi, limitati in quantità o disponibilità, inclini ad esporre affinità selvaggiamente variabili e cross-reattività, e in alcuni casi mancano riproducibilità10. Un approccio alternativo è l’espressione di SUMO con tag epitopo in cellule e organismi trasformati, ma il collegamento di tag epitopi a SUMO può ridurre artificialmente la sua coniugazione agli obiettivi proteici11. Inoltre, gli epitopi non sono utili quando vengono valutate cellule o tessuti non trasformati.
Ulp1 è una proteasi di SUMO conservata da S. cerevisiae che entrambi elabora il precursore di sumo e desumoylates proteine coniugate con Sumo12. Abbiamo sviluppato il reagente UTAG in base all’osservazione serendipitous che una mutazione della cisteina catalitica (C580S) in Ulp1’s Sumo ULP dominio (UD) non solo previene la scissione del Sumo, ma anche intrappola le proteine coniugate con sumo con elevate avidità12. Per semplicità, abbiamo fatto riferimento a questo frammento carboxy-terminale SUMO-trapping Ulp1 (C580S) come UTAG (abbreviazione di UD TAG). UTAG è una proteina di intrappolamento Pan-SUMO ricombinante che rappresenta un’utile alternativa agli anticorpi anti-SUMO utilizzati per l’isolamento e il rilevamento di proteine di SUMO-modificate. È importante sottolineare, in particolare, il SUMO coniugato in modo nativo e non solo uno o più epitopi su SUMO. Per migliorare sia la stabilità proteica che la forza legante SUMO di UTAG, abbiamo generato una variante di UTAG dal lievito a tolleranza di stress Kluyveromyces marxianus (km). KmUTAG lega saldamente i coniugati di SUMO con l’affinità nanomolare13. Inoltre, kmUTAG è resistente a temperature elevate (42 ° c), agenti riducenti (5 mM TCEP-tris (2-carbossimetilico) fosfina cloridrato), denaturanti (fino a 2 M di urea), agenti ossidanti (0,6% di perossido di idrogeno) e detergenti non ionici. Questa tolleranza allo stress è utile durante le dure condizioni di purificazione e i tempi di incubazione prolungati, assicurandone la stabilità e l’attività di cattura di SUMO. Non sorprende tuttavia che l’attività di KmUTAG di SUMO-trapping sia incompatibile con i reagenti modificanti la cisteina, i detergenti ionici e gli estratti proteici completamente denaturati. La notevole affinità e proprietà di KmUTAG indicano che questo reagente può diventare parte del repertorio standard per lo studio delle proteine SUMOilate in più specie.
Qui forniamo un metodo semplice per rilevare le proteine di SUMO-modificate in cellule di mammiferi e nematodi utilizzando una proteina di fusione fluorescente mCherry-KmUTAG ricombinante (kmUTAG-FL).
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui introduciamo l’uso di kmUTAG-FL, una proteina ricombinante, per gli studi funzionali del SUMO in cellule di mammiferi fisse e delle gonadi nematode dissezionate. KmUTAG-FL è un reagente specifico Pan-SUMO a tolleranza di stress che riconosce e intrappola le proteine native del SUMO e le catene di SUMO. Poiché la struttura terziaria di SUMO è altamente conservata, è molto probabile che le varianti di SUMO di sistemi aggiuntivi e non modello possano essere analizzate con il reagente kmUTAG-FL. In quanto tale, KmUTA…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare tutti i membri del laboratorio Kerscher per il loro sostegno, Nathalie Nguyen per la lettura critica del manoscritto, e Lidia EPP per il sequenziamento. Questo lavoro è stato sostenuto dal fondo di commercializzazione del Commonwealth Research MF16-034-LS a OK. Il sostegno alla ricerca per gli studenti W & M è stato fornito dal fondo Bailey-Huston Research e dalle borse di studio di Charles Center Honors a RY e CH.
Materials
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 30525-89-4 | |
| 6-Well Cell Culture Plates | Genesee Scientific/Olympus Plastics | 25-105 | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-545-003 | Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | Gibco 14190144 | |
| Dylight 488 conjugated AffiniPure Goat Anti-Moue IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-485-146 | Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody |
| Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses | Fisherbrand | 12545101 | |
| FLUORO-GEL II with DAPI | Electron Microscopy Sciences | 50-246-93) | Mounting media in step 1.11 |
| FLUORO-GEL with DABCO | Electron Microscopy Sciences | 17985-02 | With DAPI added to 1 µg/mL; mounting media in step 2.2.5 |
| Glycine-HCl | Fisher BioReagents | BP3815 | |
| Glycine-HCl | ACROS Organics | 6000-43-7 | |
| KmUTAG-fl | Kerafast | KmUTAG reagents are available on Kerafast.com | |
| Oneblock Western-CL blocking buffer | Prometheus | 20-313 | |
| PBS, Phosphate Buffered Saline, 10X Solution | Fisher BioReagents | BP3994 | |
| PNT2 cell line | Sigma-Aldrich | 95012613 | Normal prostate epithelium immortalized with SV40. |
| pSPOT1 | (ChromoTek GmbH) | ev-1 | https://www.chromotek.com/fileadmin/user_upload/pdfs/Datasheets/pSpot1_v1.pdf |
| SUMO 6F2 | DSHB | SUMO 6F2 | SUMO 6F2 was deposited to the DSHB by Pelisch, F. / Hay, R.T. (DSHB Hybridoma Product SUMO 6F2) |
| SUMO protease buffer [10x] | 500 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2% NP-40, 1.5 M NaCl | ||
| SUMO-2 Antibody 8A2 | DSHB | SUMO-2 8A2 | SUMO-2 8A2 was deposited to the DSHB by Matunis, M. (DSHB Hybridoma Product SUMO-2 8A2) |
| TCEP-HCL | GoldBio | 51805-45-9 | Used as a reducing agent at a concentration of 5mM |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | 9002-93-1 | Used for permeablization at 0.1% in DPBS/PBS(for worms) |
References
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