Nous présentons des techniques pour isoler, cultiver, caractériser, et différencier les cellules primaires humaines d'ancêtre de muscle (HMPCs) obtenues du tissu de biopsie de muscle squelettique. les HMPC obtenus et caractérisés par ces méthodes peuvent être utilisés pour aborder ultérieurement des questions de recherche liées à la myogenèse humaine et à la régénération des muscles squelettiques.
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Article de méthode
Isolement, culture, caractérisation et différenciation des cellules de l'ancêtre musculaire humain de la procédure de biopsie musculaire squelettique
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
L'utilisation des tissus et des cellules humaines primaires est idéale pour l'étude des processus biologiques et physiologiques tels que le processus de régénération de muscle squelettique. Il y a des défis reconnus à travailler avec les cellules souches adultes primaires humaines, en particulier les cellules progénitrices de muscle humain (HMPC) dérivées des biopsies squelettiques de muscle, y compris le faible rendement de cellules des tissus rassemblés et un grand degré d'hétérogénéité de distributeur de paramètres de croissance et de mort entre les cultures. Bien que l'intégration de l'hétérogénéité dans la conception expérimentale nécessite une plus grande taille d'échantillon pour détecter des effets significatifs, il nous permet également d'identifier les mécanismes qui sous-tendent la variabilité de la capacité d'expansion hMPC, et nous permet ainsi de mieux comprendre hétérogénéité dans la régénération des muscles squelettiques. De nouveaux mécanismes qui distinguent la capacité d'expansion des cultures ont le potentiel de conduire au développement de thérapies pour améliorer la régénération des muscles squelettiques.
Introduction
Le muscle squelettique est le plus grand système d'organes dans le corps humain, représentant 30-40% de la masse corporelle entière1. En plus de son rôle bien reconnu dans la locomotion, le muscle squelettique maintient la température et la posture du corps, et joue un rôle central dans l'homéostasie nutritive du corps entier. La recherche impliquant des participants humains, des animaux et des modèles de culture cellulaire est précieuse pour répondre aux questions relatives à la biologie et à la régénération des muscles squelettiques. L'isolement et la culture des cellules progénitrices musculaires primaires humaines (HMPC) fournit un modèle r....
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Protocole
Ce protocole a été approuvé par la Commission d'examen institutionnel de l'Université Cornell. Tous les participants ont subi un dépistage des problèmes de santé sous-jacents et ont donné leur consentement éclairé.
1. Obtenir le tissu de muscle humain par l'intermédiaire de la biopsie squelettique de muscle
- Identifiez le muscle vastus lateralis par l'intermédiaire de la palpation, des repères anatomiques, et de la contraction active du muscle.
- Palpate le vastus lateralis en ayant le participant serrer leur muscle quadriceps et de trouver le ventre du muscle, environ 1/3 du chemin de la rotule à la hanche, et juste ventro....
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Résultats
Les résultats représentatifs de cytométrie de flux de l'isolement de hMPC du tissu de muscle humain peuvent être vus dans la figure 1. les hMPC peuvent être identifiés par les premiers événements de gating basés sur la diffusion latérale et la diffusion vers l'avant pour éliminer les cellules mortes ou les débris, suivis par la sélection des cellules qui sont négatives pour 7-AAD et sont donc viables. La sélection des cellules positives pour les marqueurs de .......
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Discussion
Les HMPC primaires sont un modèle de recherche important utilisé pour comprendre la biologie des muscles squelettiques et le processus régénérateur. En outre, les HMPC ont le potentiel d'être utilisés pour la thérapie. Cependant, il y a des défis reconnus en utilisant les HMPC primaires pour la recherche et la thérapie, y compris la compréhension limitée des cellules dérivées des humains10. Il existe également une grande variation de la capacité d'expansion entre les cultures de donneurs, ce qui l.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Remerciements
Les auteurs remercient l'Université Cornell, Biotechnology Resource Center Imaging Facility pour leur aide au tri des cellules activées par la fluorescence. Nous remercions également Molly Gheller pour son aide dans le recrutement des participants et Erica Bender pour la conduite des biopsies musculaires squelettiques. Enfin, nous remercions les participants pour leur temps et leur participation à l'étude. Ce travail a été soutenu par le National Institute on Aging of the National Institutes of Health sous le numéro de prix R01AG058630 (à B.D.C. et A.E.T.), par une Glenn Foundation for Medical Research et l'American Federation for Aging Research Grant for Junior Facul....
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 0,25 % Trypsine, 2,21 mM EDTA | Corning | 25-053-Cl | Trypsine utilisée pour éliminer les hMPC adhérents des récipients de culture cellulaire |
| Plaque de culture cellulaire de 10 cm | VWR | 664160 | Plaques utilisées pour la culture de hMPC |
| Tube Falcon Falcon | 352196 | 15 mL Tubes coniques utilisés tout au long des protocoles d’isolement et de culture hMPC | |
| Plaque de culture cellulaire 24 puits | Grenier Bio-One | 662 160 | Plaques utilisées pour la culture hMPCs |
| 7-AAD Viability Staining Solution | eBioscience | 00-6993-50 | Coloration de viabilité pour l’identification des cellules vivantes lors du tri FACS |
| Alexa Fluor 488 anti-humain CD29, Clone : TS2/16 | BioLegend | 303016 | Anticorps conjugué pour FACS ; |
| Plaque de culture cellulaire noire 96 puits | Grenier Bio-One | 655079 | plaque de culture cellulaire 96 puits idéale pour l’imagerie fluorescente à l’aide du Celigo S |
| Celigo S | Nexcelcom Bioscience | Cytomètre d’imagerie utilisé pour suivre les cultures hMPC | |
| Passoire | VWR | 352350 | Passoire cellulaire pour éliminer les gros débris lors du traitement de la biopsie musculaire |
| Collagène de type I (Rat Queue) | Corning | 354236 | Collagène pour l’enrobage des plaques de culture cellulaire ; |
| Collagénase D | Roche | 11 088 882 001 | Utilisée pour la dégradation du collagène et d’autres tissus conjonctifs dans le tissu de biopsie des muscles squelettiques |
| Diméthyl Sulfoxyde | VWR | WN182 | Utilisée pour la cryoconservation des hMPCs |
| Dispase II | Sigma Life Sciences | D4693 | Une protéase utilisée pour la digestion enzymatique du tissu |
| de biopsie des muscles squelettiquesDulbecco’s Modified Eagle Medium Low Glucose en poudre | Gibco | 31600-034 | DMEM à faible teneur en glucose pour le traitement de la biopsie musculaire |
| Saline tamponnée au phosphate Dulbecco’s | Gibco | 21600-010 | PBS pour le traitement de la biopsie musculaire |
| EDTA Sel disodique dihydraté | J.T. Baker | 4040-01 ; | Requis pour le tampon FACS |
| Sérum fœtal bovin | VWR | 89510-186 ; | Sérum fœtal bovin utilisé pour les milieux de croissance hMPC |
| Ham’s F12 | Gibco | 21700-026 | Milieu de base pour hMPCs |
| Sérum équin inactivé par la chaleur | Gibco | 26-050-070 | Sérum de cheval utilisé pour fabriquer des milieux de différenciation hMPC |
| Hémocytomètre | iNCyto | DHC-N0105 | Utilisé pour compter les cellules |
| hibernation A | Gibco | A1247501 | Milieu pour préserver la biopsie des muscles squelettiques tissu |
| Hoechst 33342, chlorhydrate de trichlorhydrate | Life Technologies | H21492 | Coloration de l’ADN pour l’identification de toutes les cellules à l’aide de l’isopropanol Celigo S |
| Fisher Scientific | A416P-4 | Utilisé pour la congélation à débit contrôlé de hMPCs | |
| Tampon Moxi | Orflo | MXA006 | Tampon pour compteur de cellules automatisé |
| Cassettes Moxi Orflo | MXC002 | Cassesttes pour compteur de cellules automatisé | |
| Moxi z Mini Compteur de cellules automatisé | Orflo | Compteur de cellules automatisé Conteneur de | |
| congélation Mr. Frosty Thermo | Fisher Scientific | 5100-0001 | Récipient de congélation cellulaire à débit contrôlé disponible dans le commerce |
| Sérum de chèvre normal (10 %) | Thermo Fisher Scientific | 50062Z | Sérum de chèvre utilisé dans le tampon |
| FACSPE-Cy7 Souris anti-humaine CD56, Clone : B159 | BD Pharmingen | 557747 | Anticorps conjugué pour FACS ; |
| Pénicilline/Streptomycine 100x Solution | Corning | 30-002-CI | Antibiotiques ajoutés aux milieux de culture |
| Iodure de propidium | Thermo Fisher Scientific | P3566 | Coloration de l’ADN pour l’identification des cellules mortes à l’aide du |
| facteur de croissance des fibroblastes humains de base | Promega | G5071 | Supplément dans les milieux de croissance hMPC pour prévenir la différenciation spontanée |
| Milieu de congélation de culture cellulaire de récupération ; | Gibco | 12648-010 | Milieux utilisés pour la cryoperseve de boues de biopsie musculaire |
| Bicarbonate de sodium | Fisher Scientific | S233-3 | Ajouté aux tubes stériles à fond rond F12 |
| Ham | VWR | 60818-565 | Tubes utilisés pour FACS |
| UltraComp eBeads | eBioscience | 01-2222-42 | Perles de compensation pour l’étalonnage du débit Paramètres FACS |
Références
- Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z., Ross, R. Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr. Journal of Applied Physiology. 89 (1), 81-88 (2000).
- D'Souza, D. M., et al.
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Réimpressions et autorisations
