Ici, un modèle expérimental critique d'ischémie de membre postérieur est présenté suivi d'une batterie de tests fonctionnels, histologiques et moléculaires pour évaluer l'efficacité des thérapies angiogéniques.
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Article de méthode
Évaluation de l'angiogenèse thérapeutique dans un modèle murine de l'ischémie hindlimb
Dans cet article
Résumé
Résumé
L'ischémie critique des membres (ICL) est une affection grave qui entraîne un risque élevé d'amputation des membres inférieurs. En dépit de la revascularisation étant la thérapie d'or-standard, un nombre considérable de patients de CLI ne sont pas adaptés pour la revascularisation chirurgicale ou endovasculaire. Les thérapies angiogéniques émergent comme option pour ces patients mais sont actuellement encore à l'étude. Avant l'application chez l'homme, ces thérapies doivent être testées dans des modèles animaux et ses mécanismes doivent être clairement compris. Un modèle animal de l'ischémie postérieure (HLI) a été développé par la ligature et l'excision des artères et veines iliaques et fémorales externes distales chez les souris. Un panel complet d'essais a été assemblé pour évaluer les effets de l'ischémie et des thérapies angiogéniques putatives aux niveaux fonctionnel, histologique et moléculaire. Laser Doppler a été utilisé pour la mesure du débit et l'évaluation fonctionnelle de la perfusion. La réponse de tissu a été évaluée par l'analyse de la densité capillaire après coloration avec l'anticorps anti-CD31 sur des sections histologiques du muscle gastrocnemius et par la mesure de la densité collatérale de navire après diaphonization. L'expression des gènes angiogéniques a été quantifiée par RT-PCR ciblant des facteurs angiogéniques choisis exclusivement dans les cellules endothéliales (EC) après microdissection de capture de laser des muscles gastrocnemius de souris. Ces méthodes étaient sensibles en identifiant les différences entre les membres ischémiques et non ischémiques et entre les membres traités et non traités. Ce protocole fournit un modèle reproductible de CLI et un cadre pour tester les thérapies angiogéniques.
Introduction
La maladie artérielle périphérique (PAD) affecte principalement les membres inférieurs. La DAP est causée par l'athérosclérose, une obstruction artérielle qui peut causer une restriction grave du flux sanguin dans les membres inférieurs1. La claudication intermittente est la première manifestation de PAD et se réfère à la douleur musculaire lors de la marche. CLI est le stade le plus grave de PAD, étant diagnostiqué chez les patients qui montrent des douleurs de repos ischémiques, des ulcères ou de la gangrène2. Les patients atteints d'ICL ont un risque élevé d'amputation, surtout s'ils ne sont pas traités
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Protocole
Toutes les procédures relatives aux animaux sont conformes à la directive 2010/63/UE et ont été approuvées par l'Organe institutionnel de protection des animaux et autorisées par la DGAV, l'autorité compétente portugaise en matière de protection des animaux (numéro de licence 023861/2013)
CAUTION: Plusieurs des produits chimiques utilisés dans les protocoles sont toxiques et nocifs. Veuillez utiliser toutes les pratiques de sécurité appropriées et l'équipement de protection individuelle (gants, blouse de laboratoire, pantalons longs et chaussures à bout fermé)
1. Le modèle murine de l'ischémie de membre postérieur<....
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Résultats
Utilisant le protocole décrit, les cellules souches mésenchymales de cordon ombilical et le rayonnement ionisant de bas-dose (LDIR) ont été examinés en tant que thérapies angiogéniques putatives 11,12. Des lectures de perfusion de Doppler de laser ont été obtenues avant l'induction d'ischémie et aux points de temps pré-spécifiés s'étendant immédiatement après l'induction d'ischémie à 45 jours post-ischémie. Les lectures de perfusion de tissu par Doppler de laser .......
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Discussion
Modèles Murine de CLI ont principalement consisté en ligature de l'artère fémorale juste distal à l'origine de la femoris profunda 4,6,6,7,8,9. Cela a montré de laisser la plupart de la circulation collatérale intacte, ce qui restaure le flux sanguin vers le membre dans les 7 jours 9. L'enlèvement du l.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Remerciements
Nous remercions José Rino et Tânia Carvalho, respectivement responsables de l'installation de bioimagerie et d'histologie et de pathologie comparée de l'Instituto de Medicina Molecular Joo Lobo Antunes, respectivement. Nous remercions également Vyacheslav Sushchyk du Département d'Anatomie de la Nova Medical School/Faculdade de Ciências Médicas, Universidade Nova de Lisboa.
Référence de financement : projet financé par UID/IC/0306/2016 Fundaçao para a Ciência e a Tecnologia. Paula de Oliveira est soutenue par une bourse (SFRH/BD/80483/2011) de Fundaçao para a Ciência e Tecnologia.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 7500 PCR rapide en temps réel | Instrument | biosystèmes | |
| Réactif 1000141000 acétone | ; Attention - Réactif | ||
| d’adénosine | Valdepharm | ||
| Atipamézole | Réactif OrionPharma | Sulfate | |
| baryum (Micropaque) | Guebert | 8671404 (réf. Infarmed) | Réactif |
| Buprénorphine | RichterPharma | Réactif | |
| Carl Zeiss Opmi-1 FC Microscope chirurgical | Carl Zeiss Microscopie, Allemagne | Instrument | |
| ADNc RT2 PreAMP Kit de synthèse d’ADNc | Qiagen | 7335730 | |
| Cryostat Leica CM | Leica Microsystems | 3050S | Instrument |
| DAB kit de substrat de peroxydase | DAKO ; Vector Laboratories | K3468 | Réactif |
| peroxydase d’hydrogène | 1072090250 | Réactif ; Attention - | |
| stylo hydrophobe | Dako | 411121 | réactif ; Attention - toxique |
| Ketamidor | Richterpharma | CN :580393,7 630/01/12 Dfvf | Réactif |
| Laser Doppler perfusion imager moorLDI2-HIR | MoorLDI-V6.0, Moor Instruments Ltd, Axminster, UK | 5710 | Instrument |
| Leica DM2500 microscope droit à fond clair | Leica Microsystems | Instrument | |
| Medetor | Virbac | 037/01/07RFVPT | Réactif |
| méthanol | VWR | UN1230 | réactif ; Attention - réactif toxique et hautement inflammable |
| Papaverine | Labesfal | Pentano | |
| Isso | Merk | 1060561000 | réactif ; Attention - hautement inflammable |
| Power SYBR® ; Green | Applied Biosystems | 4309155 | Réactif |
| purifié anti-souris CD31 | Pharmingen | 550274 | Réactif |
| RNeasy Micro kit | Qiagen | 74004 | Réactif |
| Surgic-Pro 6.0 | Medtronic (Coviden) | VP733X | Suture |
| VECTASTAIN ABC HRP Kit (Peroxydase, Rat IgG) | Vectastain ABC kit ; Vector Laboratories | PK-4004 | Réactif |
| Vicryl5.0/ Vicryl 6.0 | Medtronic (Covidien) | UL202/ UL101 | Suture |
| Zeiss PALM MicroBeam Système de microdissection laser | Carl Zeiss Microscopie, Allemagne | 1023290916 | Instrument |
| Microscope stéréotaxique | Carl Zeiss Microscopie, Allemagne | Instrument | |
| Appareil photo numérique | Linux | instrument |
Références
- Becker, F., et al. Chapter I: Definitions, epidemiology, clinical presentation and prognosis. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 42 Suppl 2, S4-S12 (2011).
- Fowkes, F. G., et al. Per....
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Réimpressions et autorisations
