Hindekstremite Iskemi bir Murine modelinde terapötik anjiyogenezi değerlendirilmesi
Summary
Burada, anjiogenik tedavilerin etkinliğini değerlendirmek için fonksiyonel, histolojik ve moleküler testlerin bir pil tarafından izlenen kritik bir hindekstremite iskemi deneysel modeli sunulmuştur.
Abstract
Kritik ekstremite iskemi (CLı), alt ekstremite amputasyonu riski yüksek olan ciddi bir durumdur. Revaskülarizasyon altın standardı tedavi olmasına rağmen, önemli sayıda CLI hasta ya cerrahi veya endovasküler revaskülarizasyon için uygun değildir. Anjiyojenik tedaviler bu hastalar için bir seçenek olarak ortaya çıkmaktadır ancak halen soruşturma altındadır. İnsanlarda uygulamadan önce, bu tedaviler hayvan modellerinde test edilmelidir ve mekanizmaları açıkça anlaşılmalıdır. Hindekstremite iskemi (HLı) bir hayvan modeli, farelerde distal dış iliak ve femoral arterlerin ve damarların ligasyon ve eksizyonu ile geliştirilmiştir. İskemi ve Putatif anjiyojenik tedavilerin fonksiyonel, histolojik ve moleküler seviyelerde etkilerini değerlendirmek için kapsamlı bir test panosu toplandı. Lazer Doppler, perfüzyonun akış ölçümü ve fonksiyonel değerlendirilmesi için kullanılmıştır. Doku tepkisi, gasronemius kasının histolojik bölümlerinde Anti-CD31 antikor ile boyama sonrası kapiller yoğunluğunun analizi ile ve terleme sonrası damar yoğunluğunun ölçülmesi ile değerlendirildi. Anjiyojenik genlerin ifadesi, fare gastroknemius kaslarından lazer yakalama mikrodiseksiyondan sonra yalnızca endotel hücrelerinde (ECS) seçilen anjiyojenik faktörleri hedefleyen RT-PCR tarafından ölçülebilir. Bu yöntemler, iskemik ve iskemik olmayan ekstremite arasında ve tedavi edilen ve tedavi edilmeyen ekstremite arasındaki farklılıkları tanımlamada hassastır. Bu protokol, tekrarlanabilir bir CLı modeli ve anjiyojenik tedaviler test etmek için bir çerçeve sağlar.
Introduction
Periferik arter hastalığı (PAD) ağırlıklı olarak alt ekstremite etkiler. PAD ateroskleroz neden olur, alt ekstremite kan akışına ciddi kısıtlama neden olabilir bir arter tıkanıklığı1. Aralıklı klodicasyon PAD ilk tezahürü ve yürüyüş kas ağrısı anlamına gelir. CLı, iskemik dinlenme ağrısı, ülser veya kangren2gösteren hastalarda teşhis EDILIYOR, Pad en şiddetli aşamasıdır. CLı olan hastalarda özellikle tedavi edilmemiş3amputasyon riski yüksektir. Alt ekstremite revaskülarizasyon (ya açık cerrahi veya endovasküler prosedür) Şu anda ekstremite kurtarma elde etmek için tek yoldur. Ancak, bu prosedürler için, lezyonların yerini, arter tıkanıklığı ve geniş komorbiditesi4,5‘ i içeren nedenlerle, CLI hastalarının yaklaşık% 30 ‘ unda bu yordamlar için uygun değildir. Bu nedenle, bu başka tedavi edilemez hastalar için yeni tedaviler gereklidir, anjiyogenez tanıtımı ile daha yoğun soruşturma altında strateji olmak.
İnsanlarda test yapmadan önce, yeni terapilerin etkinliği ve güvenliği hayvan modellerinde değerlendirilmelidir. Birkaç model, genellikle fareler6,7,8,9,10içinde hindekstremite iskemi (HLI) inducing tarafından, CLI çalışması için geliştirilmiştir. Ancak, bu modeller ve/veya ekisize ve damarları ve sinirler çevreleyen da6,7,8disseke olup olmadığını arterlerin doğası da dahil olmak üzere çeşitli yönleri farklıdır 9,10. Birlikte alındığında, bu yönleri her hayvanın iskemi-reperfüzyon yaralanması şiddeti etkileyecektir, sonuçları karşılaştırmak zor hale. Bu nedenle, belirli bir anjiyojenik tedavinin etkili olup olmadığını değerlendirmek için iskemi ve farklı hedeflerin değerlendirilmesine neden olan prosedürün standartlaştırılmalıdır etkili bir protokol geliştirmek önemlidir. Tüm bu yönleri kapsayacak şekilde tasarlanan deneysel bir protokol, anjiyojenik tedavilerin etkilerini ve bunların her bir sonuçlarının her birinde etkinliğini ölçen mekanizmalar tarafından kapsamlı bir anlayış sağlayacaktır. Son zamanlarda ekibimiz tarafından yayınlanan iki farklı eserler iyi bir örnek olan11,12, hangi farklı yaklaşımlar terapötik anjiyojenezi neden bu daha fazla ayrıntı ile tarif edilecektir aynı protokol kullanılarak değerlendirildi Protokolü.
Bu protokolün genel amacı, CLı ‘nin etkilerini taklit edebilir ve deneysel anjiogenik fonksiyonel, histolojik ve moleküler etkilerinin kapsamlı bir şekilde değerlendirilmesi için deney temelini koyabilen yeniden üretilebilen bir deneysel modeli açıklamak. Ajan.
Protocol
Representative Results
Discussion
CLI murine modelleri çoğunlukla femoral arter ligasyon sadece Profunda femoris orijini distal oluşmuştur 4,5,6,7,8,9. Bu, 7 gün içinde ekstremite kan akışını geri yükler, korunmaz sirkülasyon çoğunu terk göstermiştir 9. Teminat yatağı kaldırılması femoral arter eksizyonu ile elde e…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz, sırasıyla Instituto de Medicina moleküler João Lobo Antunes Bioımaging tesis ve Histoloji ve karşılaştırmalı patoloji laboratuvarı başkanları José Rino ve Tânia Carvalho teşekkür ederiz. Ayrıca Nova Tıp Fakültesi/Faculdade de Ciências médicas, Universidade Nova de Lisboa anatomisi bölümünden Vyacheslav Sushchyk teşekkür ederiz.
Finansman referansı: UID/ıC/0306/2016 Fundação para a Ciência e a Tecnologia tarafından finanse edilen proje. Paula de Oliveira, Fundação para a Ciência e Tecnologia ‘dan bir burs (SFRH/BD/80483/2011) tarafından desteklenmektedir.
Materials
| 7500 Fast Real-Time PCR | Applied Biosystems | Instrument | |
| Acetone | Merk | 1000141000 | Reagent; Caution – highly flammable |
| Adenosine | Valdepharm | Reagent | |
| Atipamezole | OrionPharma | Reagent | |
| Barium sulphate (Micropaque) | Guebert | 8671404 (ref. Infarmed) | Reagent |
| Buprenorphine | RichterPharma | Reagent | |
| Carl Zeiss Opmi-1 FC Surgical Microscope | Carl Zeiss Microscopy, Germany | Instrument | |
| cDNA RT2 PreAMP cDNA Synthesis kit | Qiagen | 7335730 | Reagent |
| Cryostat Leica CM | Leica Microsystems | 3050S | Instrument |
| DAB peroxidase substrate kit | DAKO;Vector Laboratories | K3468 | Reagent |
| hydrogen peroxidase | Merk | 1072090250 | Reagent; Caution – nocif |
| hydrophobic pen | Dako | 411121 | Reagent; Caution – toxic |
| Ketamidor | Richterpharma | CN:580393,7 630/01/12 Dfvf | Reagent |
| Laser Doppler perfusion imager moorLDI2-HIR | MoorLDI-V6.0, Moor Instruments Ltd, Axminster, UK | 5710 | Instrument |
| Leica DM2500 upright brightfield microscope | Leica Microsystems | Instrument | |
| Medetor | Virbac | 037/01/07RFVPT | Reagent |
| methanol | VWR | UN1230 | Reagent; Caution – toxic and highly flammable |
| Papaverine | Labesfal | Reagent | |
| Pentano Isso | Merk | 1060561000 | Reagent; Caution – highly flammable |
| Power SYBR® Green | Applied Biosystems | 4309155 | Reagent |
| Purified rat anti-mouse CD31 | Pharmingen | 550274 | Reagent |
| RNeasy Micro kit | Qiagen | 74004 | Reagent |
| Surgic-Pro 6.0 | Medtronic (Coviden) | VP733X | Suture |
| VECTASTAIN ABC HRP Kit (Peroxidase, Rat IgG) | Vectastain ABC kit; Vector Laboratories | PK-4004 | Reagent |
| Vicryl5.0/ Vicryl 6.0 | Medtronic (Covidien) | UL202/ UL101 | Suture |
| Zeiss PALM MicroBeam Laser Microdissection System | Carl Zeiss Microscopy, Germany | 1023290916 | Instrument |
| Stereotaxic microscope | Carl Zeiss Microscopy, Germany | Instrument | |
| Digital camera | Linux | Instrument |
References
- Becker, F., et al. Chapter I: Definitions, epidemiology, clinical presentation and prognosis. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 42 Suppl 2, S4-S12 (2011).
- Fowkes, F. G., et al. Peripheral artery disease: epidemiology and global perspectives. Nature Reviews Cardiology. 14 (3), 156-170 (2017).
- Abu Dabrh, A. M., et al. The natural history of untreated severe or critical limb ischemia. Journal of Vascular Surgery. 62 (6), 1642-1651 (2015).
- Lejay, A., et al. A new murine model of sustainable and durable chronic critical limb ischemia fairly mimicking human pathology. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 49 (2), 205-212 (2015).
- Sprengers, R. W., Lips, D. J., Moll, F. L., Verhaar, M. C. Progenitor cell therapy in patients with critical limb ischemia without surgical options. Annals of Surgery. 247 (3), 411-420 (2008).
- Lotfi, S., et al. Towards a more relevant hind limb model of muscle ischaemia. Atherosclerosis. 227 (1), 1-8 (2013).
- Masaki, I., et al. Angiogenic gene therapy for experimental critical limb ischemia: acceleration of limb loss by overexpression of vascular endothelial growth factor 165 but not of fibroblast growth factor-2. Circulation Research. 90 (9), 966-973 (2002).
- Limbourg, A., et al. Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia. Nature Protocols. 4 (12), 1737-1746 (2009).
- Hellingman, A. A., et al. Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 40 (6), 796-803 (2010).
- Brevetti, L. S., et al. Exercise-induced hyperemia unmasks regional blood flow deficit in experimental hindlimb ischemia. Journal of Surgical Research. 98 (1), 21-26 (2001).
- Ministro, A., et al. Low-dose ionizing radiation induces therapeutic neovascularization in a pre-clinical model of hindlimb ischemia. Cardiovascular Research. 113 (7), 783-794 (2017).
- Pereira, A. R., et al. Therapeutic angiogenesis induced by human umbilical cord tissue-derived mesenchymal stromal cells in a murine model of hindlimb ischemia. Stem Cell Research Therapy. 7 (1), 145 (2016).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
