تقييم استقرار التخزين من الحويصلات خارج الخلية
Summary
هنا نقدم بروتوكول قابل للتطبيق بسهوله لتقييم استقرار التخزين من الحويصلات خارج الخلية ، وهي مجموعه من الجسيمات النانويه التي تحدث بشكل طبيعي التي تنتجها الخلايا. يتم تحميل الحويصلات مع جلوكوروداز كانزيم نموذج وتخزينها في ظل ظروف مختلفه. بعد التخزين ، يتم تقييم المعلمات الفيزيائية الكيميائية ونشاط الانزيم المغلف.
Abstract
الحويصلات خارج الخلية (المركبات الحيوية) هي أهداف واعده في البحوث الحالية ، لاستخدامها كادويه ، وناقلات المخدرات ، والمؤشرات الحيوية. لتطويرهم السريري ، ليس فقط نشاطهم الصيدلاني مهم ولكن أيضا إنتاجهم يحتاج إلى تقييم. وفي هذا السياق ، تركز البحوث علي عزل المركبات الخاصة ، وتوصيفها ، وتخزينها. تهدف المخطوطة الحالية إلى توفير اجراء لتقييم تاثير ظروف التخزين المختلفة علي المركبات الحيوية ، دون التلاعب بالجينات أو المقايسات الوظيفية المحددة. وهذا يجعل من الممكن الحصول بسرعة علي الانطباع الأول من استقرار المركبات التي تحت حاله تخزين معينه ، ويمكن مقارنه المركبات التي تستمد من مصادر الخلايا المختلفة بسهوله. ويستند قياس الاستقرار علي المعلمات الفيزيائية الكيميائية للمركبات (الحجم ، وتركيز الجسيمات ، والمورفولوجية) والحفاظ علي نشاط حمولتها. يتم تقييم هذا الأخير من قبل التغليف بوساطة سابونين من انزيم بيتا جلوكوروداز في المركبات أليفه. جلوكوروداز يعمل كبديل ويسمح للقياس الكمي سهله عن طريق انشقاق جزيء مراسل الفلورسنت. يمكن ان يكون هذا البروتوكول أداه للباحثين في البحث عن ظروف التخزين التي تحتفظ علي النحو الأمثل خصائص EV لدفع البحوث EV إلى التطبيق السريري.
Introduction
المركبات أليفه هي جسيمات نانويه الغشاء التي تنتجها تقريبا جميع أنواع الخلايا. للخلايا الثدييات ، يمكن تقسيم المركبات الاساسيه إلى مجموعتين رئيسيتين مع مسارات إنتاج متميزة1،2. وتنتج الحويصلات غشاء ، مع نطاق حجم من تقريبا 100-1000 نانومتر ، من قبل الناشئة مباشره من غشاء الخلية. وتستمد exosomes ، الحجم 30-200 نانومتر ، من الهيئات متعددة الخلايا التي شكلتها الداخل في مهدها إلى التنظير الداخلي الذي فتيل في وقت لاحق مع غشاء الخلية للإفراج عن التماثيل المتعددة في وقت واحد. الوظيفة الرئيسية لهذه الحويصلات هو نقل المعلومات بين الخلايا3. لهذا الغرض ، يتم فرز الشحنات مثل RNA والحمض النووي والبروتينات بنشاط في نفوسهم. المركبات التي يمكن ان تنقل مجموعه متنوعة من الآثار علي أهدافها ، مع الآثار المترتبة علي كل من الحالة الصحية والمرض. علي جانب واحد, انها التوسط الآثار الايجابيه مثل تجديد الانسجه, العرض مستضد, أو اثار المضادات الحيوية, مما يجعلها أهداف الميمون لتنميتها كما التداوي4,5. علي الجانب الآخر, المركبات النارية يمكن ان تعزز الاوعيه الدموية الورم6, حمل اثار المارة في الاستجابات الإجهاد7, وقد تلعب دورا في امراض المناعة الذاتية8 والامراض التهابيه9. التالي ، فانها قد تكون عنصرا رئيسيا لفهم أفضل للعديد من الآثار المرضية. ومع ذلك ، فان وجود المركبات المتغيرة في الامراض المنوعة ، مثل السرطان10،11،12 واضطرابات القلب والاوعيه الدموية13، وسهوله الوصول اليها في الدم والبول يجعلها مثاليه حيوي. وأخيرا ، والتوافق البيولوجي جيده14 وقدرتها علي استهداف المتاصله جعل المركبات الحيوية أيضا مثيره للاهتمام لتسليم المخدرات15. في هذه المخطوطة ، نقوم بوصف بروتوكول لتقييم استقرار التخزين للمركبات المركبة التي تستمد من خلايا الثدييات ، وهي خاصيه هامه لا يزال التحقيق فيها قليلا.
للتطوير السريري للمركبات المركبات الخاصة ، لا تزال هناك العديد من العقبات للتغلب علي16، بما في ذلك تقييم اثارها العلاجية ، والإنتاج ، وتنقيه ، وتخزين17. بينما-80 درجه مئوية وينظر علي نطاق واسع علي انها معيار الذهب لتخزين EV18، والمجمدات المطلوبة مكلفه ، والحفاظ علي سلسله الباردة المطلوبة من الإنتاج إلى المريض يمكن ان تكون صعبه. وعلاوة علي ذلك ، تشير بعض التقارير إلى ان التخزين في-80 درجه مئوية لا يزال لا يحفظ علي النحو الأمثل المركبات أليفه ويدفع خسارة في وظيفة EV19,20. وقد اقترحت طرق أخرى ، مثل تجميد التجفيف21أو22 أو التجفيف بالرذاذ23، كبدائل محتمله للتخزين المجمد للمركبات المركبة.
والطريقة المثلي لتقييم استقرار التخزين هي اختبار المركبات الحيوية في المقايسات الوظيفية أو من خلال تقييم علامة محدده ، علي سبيل المثال ، نشاطها المضاد للبكتيريا19. وهذا ممكن عندما يكون التاثير المطلوب من الحويصلات المعروفة وعندما مجموعه واحده متميزة من المركبات التي يمكن دراستها. وإذا ما قورنت المركبات التي من مصادر مختلفه للخلايا (علي سبيل المثال ، بالنسبة لتغليف المخدرات) أو إذا لم تكن هناك قراءات وظيفية معروفه ، فانه لم يعد من الممكن تقييم التغيرات الناجمة عن التخزين بطريقه مباشره.
من ناحية أخرى ، ببساطه تقييم التغييرات في المعلمات الفيزيائية الكيميائية ، مثل الحجم ، واستعاده الجسيمات ، وتركيز البروتين ، لا يتنبا دائما التغيرات في نشاط EV ، كما هو مبين في براءة اختراع الاخيره20.
هنا ، ونحن نقدم بروتوكول قابل للتطبيق بسهوله لقياس استقرار التخزين من المركبات أليفه من خلال تقييم المعلمات الفيزيائية الكيميائية جنبا إلى جنب مع نشاط انزيم بيتا جلوكوروداز مغلفه كبديل للبضائع من المركبات أليفه. يتم تحميل الانزيم من قبل حضانة سابونين ، طريقه معتدله التي أنشئت مع المركبات الخاصة من مصادر مختلفه21،24،25. يشكل سابونين المسام العابرة في غشاء EV ، والذي يسمح بامتصاص الانزيم في الحويصلة. كما الانزيمات عرضه لتفقد نشاطها إذا تعرضت لظروف التخزين غير المواتية ، فهي بديل مثالي لتقييم الحفاظ علي الشحنات الوظيفية للمركبات المركبات الخاصة.
وقد أثبتنا ان تطبيق هذا البروتوكول علي المركبات التي تستمد من الخلايا الجذعية البشرية (MSCs) ، والخلايا المبطنة بالوريد السري البشري (HUVECs) ، والخلايا الظهاريه السرطانية البشرية (A549) تؤدي في الواقع إلى اختلافات كبيره في استقرار التخزين بين خطوط الخلايا المختلفة ، والتي ينبغي ان تؤخذ في الاعتبار عند اختيار مصدر EV21.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه المخطوطة ، نقدم بروتوكولا شاملا لدراسة استقرار المركبات التي تخضع لظروف تخزين مختلفه. مع مزيج من جلوكوروداز مغلفه كما قراءات وظيفية وتقييم المعلمات الفيزيائية للمركبات المركبات الخاصة ، وبروتوكول يسمح لتقييم الاستقرار التخزين مباشره من المركبات الخاصة ومقارنه المركبات الخاصة م?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل برنامج البحوث النانوماتفوتوره المبتدئين الذي قدمته وزاره التعليم والبحوث الاتحادية في ألمانيا (رقم المنحة 13XP5029A). وقد تم دعم ماكسيميليان ريختر من قبل المؤسسة الاكاديميه المانيه للمنح الدراسية من خلال زمالة الدكتوراه.
Materials
| 1,2 dimyristoyl-sn glycero-3-phospho-choline (DMPC) | Sigma-Aldrich | P2663-25MG | |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-choline (DPPC) | Sigma-Aldrich | P4329-25MG | |
| 225 cm² cell culture flasks | Corning | 431082 | Used with 25 ml of medium |
| 30 kDa regenerated cellulose membrane | Wyatt Technology Europe | 1854 | |
| 350 µm spacer | Wyatt Technology Europe | ||
| Automated fraction collector | Thermo Fisher Scientific | ||
| Beta-glucuronidase | Sigma-Aldrich | G7646-100KU | |
| Chloroform | Fisher scientific | C/4966/17 | |
| Column oven | Hitachi High-Technologies Europe | ||
| D-(+)-Trehalose dihydrate | Sigma-Aldrich | T9531-10G | |
| DAWN HELEOS II, Multi-angle light scattering detector | Wyatt Technology Europe | ||
| Durapore Membrane filter, PVDF, 0,1 µm, 47 mm | Merck | VVLP04700 | Used for the preparation of buffers for AF4 |
| EBM-2 | Lonza Verviers, S.p.r. | CC-3156 | Endothelial Cell Growth basal medium, used for the serum free culture of HUVEC cells |
| Eclipse dualtec | Wyatt Technology Europe | ||
| EGM-2 | Lonza Verviers, S.p.r. | CC-3162 | Endothelial Cell Growth medium, used for the normal culture of HUVEC cells |
| ELISA Plate Sealers | R&D Systems | DY992 | used for sealing of 96-well plates for the glucuronidase assay |
| Ethanol | Fisher scientific | E/0665DF/17 | |
| Extruder Set With Holder/Heating Block | Avanti Polar Lipids | 610000-1EA | |
| Filter support | Avanti Polar Lipids | 610014-1EA | used for liposome preparation |
| Fluorescein di-β-D-glucoronide | Thermo Fisher Scientific | F2915 | |
| Gibco PBS-tablets+CA10:F36 | Thermo Fisher Scientific | 18912014 | |
| Hettich Universal 320 R | Andreas Hettich GmbH & Co.KG | Used for pelleting cells at 300 g | |
| Hettich Rotina 420 R | Andreas Hettich GmbH & Co.KG | Used for pelleting larger debris at 3000 g | |
| HUVEC cells | Lonza Verviers, S.p.r. | C2517A | |
| Kimble FlexColumn 1X30CM | Kimble | 420401-1030 | |
| Lyophilizer ALPHA 2-4 LSC | Christ | ||
| Microcentrifuge Tubes, Polypropylene | VWR international | 525-0255 | the tubes used for all EV-handling, found to be more favorable than comparable products from other suppliers regarding particle recovery |
| Nanosight LM14 equipped with a green laser | Malvern Pananalytical | ||
| Nanosight-software version 3.1 | Malvern Pananalytical | ||
| Nucleopore 200 nm track-etch polycarbonate membranes | Whatman/GE Healthcare | 110406 | used for liposome preparation |
| PEEK Inline filter holder | Wyatt Technology Europe | ||
| Phosphotungstic acid hydrate | Sigma-Aldrich | 79690-25G | |
| Polycarbonate bottles for ultracentrifugation | Beckman Coulter | 355622 | |
| QuantiPro BCA Assay Kit | Sigma-Aldrich | QPBCA-1KT | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Scanning electron microscopy Zeiss EVO HD 15 | Carl Zeiss AG | ||
| Sepharose Cl-2b | GE Healthcare | 17014001 | |
| SEM copper grids with carbon film | Plano | S160-4 | |
| Small AF4 channel | Wyatt Technology Europe | ||
| Sputter-coater Q150R ES | Quorum Technologies | ||
| Transmission electron microscopy JEOL JEM 2011 | Oxford Instruments | ||
| Type 45 Ti ultracentrifugation rotor | Beckman Coulter | 339160 | |
| Ultimate 3000 Dionex autosampler | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultimate 3000 Dionex isocratic pump | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultimate 3000 Dionex online vacuum degasser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultracentrifuge OptimaTM L-90 K | Beckman Coulter | ||
| UV detector | Thermo Fisher Scientific | ||
| Whatman 0.2 µm pore size mixed cellulose filter | Whatman/GE Healthcare | 10401712 | Used for the filtration of all buffers used with the EVs and in SEC |
References
- Stremersch, S., De Smedt, S. C., Raemdonck, K. Therapeutic and diagnostic applications of extracellular vesicles. Journal of Controlled Release. 244, 167-183 (2016).
- Fuhrmann, G., Herrmann, I. K., Stevens, M. M. Cell-derived vesicles for drug therapy and diagnostics: Opportunities and challenges. Nano Today. 10 (3), 397-409 (2015).
- Goes, A., Fuhrmann, G. Biogenic and Biomimetic Carriers as Versatile Transporters To Treat Infections. ACS Infectious Diseases. 4 (6), 881-892 (2018).
- György, B., Hung, M. E., Breakefield, X. O., Leonard, J. N. Therapeutic Applications of Extracellular Vesicles: Clinical Promise and Open Questions. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 439-464 (2015).
- Schulz, E., et al. Biocompatible bacteria-derived vesicles show inherent antimicrobial activity. Journal of Controlled Release. 290, 46-55 (2018).
- Feng, Q., et al. A class of extracellular vesicles from breast cancer cells activates VEGF receptors and tumour angiogenesis. Nature Communications. 8, 14450 (2017).
- Bewicke-Copley, F., et al. Extracellular vesicles released following heat stress induce bystander effect in unstressed populations. Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1340746 (2017).
- Xu, Y., et al. Macrophages transfer antigens to dendritic cells by releasing exosomes containing dead-cell-associated antigens partially through a ceramide-dependent pathway to enhance CD4(+) T-cell responses. Immunology. 149 (2), 157-171 (2016).
- Buzas, E. I., György, B., Nagy, G., Falus, A., Gay, S. Emerging role of extracellular vesicles in inflammatory diseases. Nature Reviews Rheumatology. 10, 356 (2014).
- Rajappa, P., et al. Malignant Astrocytic Tumor Progression Potentiated by JAK-mediated Recruitment of Myeloid Cells. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 23 (12), 3109-3119 (2017).
- Umezu, T., et al. Exosomal miR-135b shed from hypoxic multiple myeloma cells enhances angiogenesis by targeting factor-inhibiting HIF-1. Blood. 124 (25), 3748-3757 (2014).
- Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).
- Boulanger, C. M., Loyer, X., Rautou, P. -. E., Amabile, N. Extracellular vesicles in coronary artery disease. Nature Reviews Cardiology. 14, 259 (2017).
- Zhu, X., et al. Comprehensive toxicity and immunogenicity studies reveal minimal effects in mice following sustained dosing of extracellular vesicles derived from HEK293T cells. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324730 (2017).
- Vader, P., Mol, E. A., Pasterkamp, G., Schiffelers, R. M. Extracellular vesicles for drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 106, 148-156 (2016).
- Ingato, D., Lee, J. U., Sim, S. J., Kwon, Y. J. Good things come in small packages: Overcoming challenges to harness extracellular vesicles for therapeutic delivery. Journal of Controlled Release. 241, 174-185 (2016).
- Gimona, M., Pachler, K., Laner-Plamberger, S., Schallmoser, K., Rohde, E. Manufacturing of Human Extracellular Vesicle-Based Therapeutics for Clinical Use. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1190 (2017).
- Jeyaram, A., Jay, S. M. Preservation and Storage Stability of Extracellular Vesicles for Therapeutic Applications. The AAPS Journal. 20 (1), 1 (2017).
- Lőrincz, &. #. 1. 9. 3. ;. M., et al. Effect of storage on physical and functional properties of extracellular vesicles derived from neutrophilic granulocytes. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 25465 (2014).
- Kreke, M., Smith, R., Hanscome, P., Peck, K., Ibrahim, A. Processes for producing stable exosome formulations. US patent. , (2016).
- Frank, J., et al. Extracellular vesicles protect glucuronidase model enzymes during freeze-drying. Scientific Reports. 8 (1), 12377 (2018).
- Charoenviriyakul, C., Takahashi, Y., Nishikawa, M., Takakura, Y. Preservation of exosomes at room temperature using lyophilization. International Journal of Pharmaceutics. 553 (1), 1-7 (2018).
- Kusuma, G. D., et al. To Protect and to Preserve: Novel Preservation Strategies for Extracellular Vesicles. Frontiers in Pharmacology. 9 (1199), (2018).
- Haney, M. J., et al. Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson’s disease therapy. Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).
- Fuhrmann, G., Serio, A., Mazo, M., Nair, R., Stevens, M. M. Active loading into extracellular vesicles significantly improves the cellular uptake and photodynamic effect of porphyrins. Journal of Controlled Release. 205, 35-44 (2015).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Gardiner, C., Ferreira, Y. J., Dragovic, R. A., Redman, C. W. G., Sargent, I. L. Extracellular vesicle sizing and enumeration by nanoparticle tracking analysis. Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 19671 (2013).
- Vestad, B., et al. Size and concentration analyses of extracellular vesicles by nanoparticle tracking analysis: a variation study. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1344087 (2017).
- Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Scientific Reports. 6, 36162 (2016).
- Bhattacharjee, S. DLS and zeta potential – What they are and what they are not. Journal of Controlled Release. 235, 337-351 (2016).
- Van Deun, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24858 (2014).
- Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
- Patel, D. B., et al. Impact of cell culture parameters on production and vascularization bioactivity of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles. Bioengineering & Translational Medicine. 2 (2), 170-179 (2017).
- Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5 (1), 32945 (2016).
- Zhang, H., et al. Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation. Nature Cell Biology. 20 (3), 332-343 (2018).
- Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 29509 (2015).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).
