바깥쪽을 바라보며: 시안박테리아 방출 탄수화물 고분자 및 단백질 의 분리
Summary
여기서, 시안박테리아 방출 된 탄수화물 중합체의 분리 및 그들의 엑소프로테옴의 격리에 대한 프로토콜이 설명된다. 두 절차 모두 추가 분석 또는 응용 분야에 사용할 수 있는 고순도의 중합체 또는 단백질을 얻기 위한 주요 단계를 구현합니다. 또한 특정 사용자 요구에 따라 쉽게 조정할 수 있습니다.
Abstract
시아노박테리아는 이종대당및단백질과같은세포외환경으로광범위한생체분자를능으로분비할수있습니다. 이 생체 분자의 확인 및 특성화는 그들의 분비 경로에 대한 지식을 향상시키고 그(것)들을 조작하는 것을 도울 수 있습니다. 또한, 이러한 생체 분자 중 일부는 생명 공학 응용 분야에서도 흥미롭습니다. 여기서 설명된 것은 시안박테리아 방출 탄수화물 중합체 및 단백질의 쉽고 신속한 분리를 위한 두 가지 프로토콜이다. 방출된 탄수화물 중합체의 분리 방법은 유기 용매를 사용하는 수성 용액에서 다당류의 기존 침전 기술을 기반으로합니다. 이 방법은 중합체의 특성을 보존하고 동시에 세포 파편 및 배양 배지에서 오염 물질의 존재를 방지한다. 공정의 끝에서, 용약화된 중합체는 최종 의도된 용도에 따라 사용 되거나 특성화될 준비가 되거나 추가의 정제를 실시할 수 있다. 시아노박테리아 엑소프로테오메의 분리에 관해서는, 이 기술은 원심분리 및 여과에 의한 주요 오염물질을 제거한 후 무세포 배지의 농도에 기초한다. 이 전략은 막 수송기 또는 외부 막 소포를 통해 세포외 milieu에 도달하는 단백질의 믿을 수 있는 격리를 허용합니다. 이 단백질은 표준 질량 분석 기술을 사용하여 이후에 확인될 수 있습니다. 여기에 제시 된 프로토콜은 광범위한 시아노 박테리아뿐만 아니라 다른 박테리아 균주에도 적용 될 수 있습니다. 더욱이, 이러한 절차는 제품의 최종 사용, 필요한 순도 및 세균 균주에 따라 용이하게 맞춤화될 수 있다.
Introduction
시아노박테리아는 유망한 생명공학/생명의학 응용 분야와 함께 천연 제품의 다산 공급원으로 널리 인정받고 있습니다. 따라서, 시아노박테리아 분비 메커니즘을 이해하고 추출/회수 방법의 최적화는 효율적인 미생물 세포 공장으로서 시아노박테리아를 구현하는 데 필수적입니다.
많은 시아노박테리아 균주는 주로 이종대당에 의해 형성된 세포외 고분자 물질(EPS)을 생성할 수 있으며, 이는세포 표면과 연관되거나 배지 1로 방출된다. 이 방출된 탄수화물 중합체는 다른 박테리아에서 그들에 비해 명백한 특징을 가지고 있습니다, 이는 응용의넓은 범위에 적합하게 (예를 들어, 항 바이러스 2, 면역 자극3,항산화44) 금속 킬레이트5, 유화6, 약물 전달 제7,8). 이들 중합체의 분리를 위한 방법론은 크게 수율 향상뿐만 아니라 수득된 폴리머의 증가된 순도 및 특이적 물성에기여한다. 중합체의 분리를 위한 이들 방법의 대부분은 중합체의 강한 음이온 성질9,10으로인해 쉽게 달성되는 배양 배지로부터의 침전 전략에 의존한다. 또한, 침전 단계에서 사용되는 용매의 제거는 증발 및/또는 호혜화에 의해 급속히 달성될 수 있다. 예측 된 응용 프로그램에 따라, 다른 단계는 트리클로로 아세트산 (TCA) 처리, 여과, 또는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 포함하는 최종 제품을 맞추기 위해 중합체 침전 후 또는 전에 결합 될 수있다 열 정제10.
시아노박테리아는 또한 막 수송기(classical)(11) 또는 소포(non-classical)에 의해 매개되는 경로를 통해 광범위한단백질을 분비할 수 있다(12). 따라서, 시아노박테리아 엑소테오솜의 분석은 시아노박테리아 단백질 분비 메커니즘을 이해하고 조작하고 이들 단백질의 특정 세포외 기능을 이해하는 데 필수적인 도구를 구성한다. 탈전의 신뢰할 수있는 격리 및 분석은 분비 된 단백질의 풍부가 상대적으로 낮기 때문에 세포 외 밀리외의 농도를 필요로합니다. 또한, 다른 물리적 또는 화학적 단계(예를 들어, 원심분리, 여과 또는 단백질 침전)는 얻어진 엑소테오므의 품질을 최적화할수 있고, 단백질 함량을 풍부하게 하고, 오염물질의 존재를 피할 수 있다(예를 들어, 안료, 탄수화물 등) 14세 , 샘플에서 세포내 단백질의 우위 또는 15. 그러나, 몇몇은의 이 단계는 또한 편향된 분석으로 이끌어 내는 검출될 수 있는 단백질의 세트를 제한할 수 있습니다.
이 작품은 시안박테리아 배양 배지로부터 방출된 탄수화물 중합체 및 엑소프로테옴의 분리를 위한 효율적인 프로토콜을 설명합니다. 이러한 프로토콜은 여기에 제시된 기본 단계를 유지하면서 연구의 특정 목표및 사용자 요구에 쉽게 적응할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
세균 분비 메커니즘을 더 잘 이해하고 방출된 제품을 연구하기 위해 세포외 세균 환경에 존재하는 생체 분자의 효율적인 격리 및 분석을 입증하는 것이 매우 중요합니다(예: 방출됨) 탄수화물 중합체 및 단백질).
시아노박테리아 세포외 탄수화물 중합체는 그들의 조성물을 구성하는 상이한 단당류의 수및 비율로 인해 극도로 복잡하다 1. 이러한 고분자 물질?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 FUNdo Europeu de Desenvolvimento 지역 (FEDER) 기금을 통해 COMPETE 2020 – 경쟁력 및 국제화를위한 오페라 프로그램 (POCI), 포르투갈 2020, FCT를 통해 포르투갈 어 펀드에 의해 지원되었습니다 – Fundação para a Ciência e Tecnologia/Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino 슈페리어 프로젝트 POCI-01-0145-FEDER-028779 및 보조금 SFRH/BD/99715/2014(CF).
Materials
| Dialysis membranes | Medicell Membranes Ltd | DTV.12000.07 | Visking Tubing Size 7, Dia 23.8 mm, Width 39-41 mm 30m Roll |
| Ethanol 96% | AGA – Álcool e Géneros Alimentares, S.A. | 4.000.02.02.00 | Fermentation ethyl alcohol 96% AGA |
| PES Filter 0.2 μm | Fisher Scientific, Lda | 15206869 | Syringe filter polystyrene 33MM 0.2µM STR |
| Amicon Ultra-15, Ultracel-3K | Merck Millipore Ltd. | UFC900324 | Centrifugal filters with a nominal molecular weight cut-off of 3 kDa |
| Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay | Fisher Scientific, Lda | 10741395 | Green-to-blue, precise, detergent-compatible assay reagent to measure total protein concentration |
| Brillant Blue G Colloidal Concentrate | Sigma Aldrich Química SL | B2025-1EA | Coomassie blue |
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