Verwenden von Microtiter Dish Radiolabeling für mehrere In-Vivo-Messungen von Escherichia coli (p)ppGpp gefolgt von dünnschichtiger Chromatographie
Summary
Das Wachstum von radioaktiv markierten Bakterienkulturen in Mikrotiter-Gerichten ermöglicht eine Probenahme mit hohem Durchsatz, die mehrere technische und biologische Replizierungen von Nukleotid-Pool-Überfluss ermöglicht, einschließlich der von (p)ppGpp. Die Auswirkungen von Wachstumsübergängen, die durch Quellen physiologischen Stresses sowie Erholung von Stress hervorgerufen werden, können überwacht werden.
Abstract
Das (p)ppGpp-Nukleotid fungiert als globaler Regulator bei Bakterien als Reaktion auf eine Vielzahl von körperlichen und ernährungsphysiologischen Belastungen. Es hat einen schnellen Beginn, in Sekunden, die zu einer Anhäufung von Ebenen führt, die sich denen von GTP-Pools nähern oder übertreffen. Stressumkehr gelegentlich ein schnelles Verschwinden von (p)ppGpp, oft mit einer Halbwertszeit von weniger als einer Minute. Das Vorhandensein von (p)ppGpp führt zu Veränderungen der zellulären Genexpression und des Stoffwechsels, die den schädlichen Auswirkungen von Stress entgegenwirken. Gram-negative und gram-positive Bakterien haben unterschiedliche Reaktionsmechanismen, aber beide hängen von (p)ppGpp-Konzentration ab. In jedem Fall ist es notwendig, gleichzeitig viele radioaktiv markierte Bakterienkulturen in Zeitintervallen zu überwachen, die während kritischer Stressübergangsperioden von 10 Sekunden bis Stunden variieren können. Dieses Protokoll behebt diese technische Herausforderung. Die Methode nutzt temperatur- und schüttergesteuerte Mikrotiter-Schalen-Inkubatoren, die eine parallele Überwachung des Wachstums (Absorption) und eine schnelle Probenahme von einheitlich phosphatradioaktiv markierten Kulturen ermöglichen, um Nukleotidbecken durch Dünnschichtchromatographie auf PEI-Zellulose. Für mehrere technische und biologische Wiederholungen von Analysen werden geringe Probenmengen benötigt. Komplexe Wachstumsübergänge wie diauxisches Wachstum und schnelle (p)ppGpp-Fluktuationsraten können mit dieser Methode quantitativ bewertet werden.
Introduction
Der (p)ppGpp zweite Bote ist ein globaler Regulator, der die Expression einer großen Anzahl von Genen moduliert, einschließlich Genen zur Synthese von Ribosomen und Aminosäuren1,2. Obwohl zunächst in Escherichia coli3entdeckt, (p)ppGpp kann sowohl in Gram-positiven und Gram-negativen Bakterien als auch in pflanzende Chloroplasten4,5gefunden werden. Bei E. coli und anderen Gram-negativen Bakterien interagiert (p)ppGpp direkt mit RNA-Polymerase an zwei verschiedenen Stellen6,7,8. In Gram-Positiven hemmt (p)ppGpp die GTP-Fülle, die von CodY wahrgenommen wird, einem GTP-bindenden Protein mit genspezifischen DNA-Erkennungsmotiven, die zur Regulation9,10führen. p)ppGpp sammelt sich als Reaktion auf den Hunger todbringend für verschiedene Nährstoffe und Stressbedingungen an, was zu langsamem Wachstum und Anpassungen der Genexpression führt, um eine Anpassung an Stress11,12zu ermöglichen.
Der netto angesammelte ppGpp spiegelt ein Gleichgewicht zwischen Synthetase- und Hydrolaseaktivitäten wider. In E. coli RelA ist eine starke Synthetase und SpoT ist bifunktional, mit einer starken Hydrolase und einer schwachen Synthetase, die jeweils unterschiedlich in einer stressabhängigen Weise reguliert werden könnten. Die starke RelA-Synthetase wird aktiviert, wenn die Verfügbarkeit von codon-spezifizierter geladener tRNA an die ribosomale A-Stelle gebunden ist, wenn sie nicht mit den Anforderungen der Proteinsynthese13,14,15Schritt hält. Die schwache SpoT (p)ppGpp-Synthetase wird aktiviert, während die starke (p)ppGpp-Hydrolase als Reaktion auf andere Stressbedingungen und durch andere Mechanismen gehemmt wird. Unter bestimmten Bedingungen können Proteine wie ACP oder Rsd an SpoT binden, was auch das Gleichgewicht zwischen Hydrolyse und Synthese16,17verändert. In Gram-Positiven spiegeln Synthese und Hydrolyse ein komplexeres Gleichgewicht zwischen einem einzelnen RelA SpoT-Homolog (RSH)-Protein mit starken Synthese- und Hydrolyseaktivitäten sowie kleineren Hydrolasen und/oder Synthetasen12wider.
Die (p)ppGpp-Nukleotide wurden zuerst als ungewöhnliche 32P-markierte Flecken entdeckt, die auf Autoradiogrammen von Dünnschichtchromatogrammen (TLC) während einer strengen Reaktion durch Aminosäurehunger3erschienen sind. Detailliertere Kennzeichnungsprotokolle wurden überprüft 18. Das hier beschriebene Protokoll (Abbildung 1) ist eine Änderung dieser Protokolle, die es ermöglicht, das Wachstum mehrerer Proben auf Mikrotiterplatten zu überwachen. Dies erleichtert mehrere biologische und technische Schätzungen von (p)ppGpp-Überflussänderungen und wurde ursprünglich für Studien von diauxischen Schichten19entwickelt. Die Kennzeichnung von (p)ppGpp mit 32P und die Detektion durch TLC ermöglicht auch Messungen von (p)ppGpp Abbauraten. Es wurden alternative Methoden entwickelt, um (p)ppGpp-Spiegel wie Massenspektrometrie, HPLC20, fluoreszierende Chemosensoren21,22und GFP-Genfusionen an Promotoren zu bestimmen, die von ppGpp23betroffen sind, 24. Fluoreszierende Chemosensoren haben derzeit aufgrund kleiner Spektralverschiebungen nach Bindung ppGpp sowie Problemen bei der Unterscheidung zwischen ppGpp und pppGpp21einen begrenzten Einsatz. Diese Methode ist effizient, um (p)ppGpp in vitro zu erkennen, aber nicht in zellulären Extrakten. Die Methoden mit HPLC wurdenum 20 verbessert, erfordern aber teure Geräte und sind nicht gut an hohe Durchsatz angepasst. Schließlich können GFP-Fusionen eine Schätzung der ppGpp-abhängigen Aktivierung oder Hemmung ergeben, messen jedoch ppGpp selbst nicht. Obwohl jede dieser alternativen Methoden wertvoll ist, erfordern sie teure Ausrüstung oder eine erhebliche Praktische Zeit, oder sie sind ansonsten nicht für mehrere kinetische Probenahmen und nachfolgende Verarbeitungen geeignet. Mit dem hier beschriebenen Verfahren können 96 Proben auf sechs TLC-Platten in etwa 20 min (18 Proben pro Platte) aufgebracht werden, die durch TLC-Entwicklung in weniger als ein paar Stunden gelöst werden, wobei quantitative Daten nach mehreren Stunden oder über Nacht, je nach Etikettierung, intensität.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Nahe eine einheitliche Kennzeichnung der Zellen ist ein entscheidender Schritt für dieses Protokoll. Daher ist die Verwendung definierter Medien wie MOPS- oder Tris-Medien von entscheidender Bedeutung, um eine Variation der Phosphatkonzentrationen des Trägers und spezifische Aktivitäten zu ermöglichen. Phosphatgepufferte Medien wie M9 oder Media A können nicht verwendet werden. Die meisten undefinierten Medien enthalten variable Mengen an Phosphat, wie LB, Trypton und Casaminosäuren. Das Phosphatisotop 33<…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde vom Intramural Research Program, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, NIH, unterstützt.
Materials
| (NH4)6(MO7)24 | Fisher Scientifics | A-674 | |
| Autoradiography film | Denville scientific inc. | E3218 | |
| CaCl2 | J.T.Baker | 1-1309 | |
| Chloramphenicol | RPI | C61000-25.0 | |
| CoCl2 | Fisher Scientifics | C-371 | |
| CuSO4 | J.T.Baker | 1843 | |
| FeSO4 | Fisher Scientifics | I-146 | |
| Formic acid | Fisher Biotech | BP1215-500 | |
| Glucose | Macron | 4912-12 | |
| H3BO4 | Macron | 2549-04 | |
| H3PO4 | J.T.Baker | 0260-02 | |
| K2SO4 | Sigma | P9458-250G | |
| KH2PO4 | Fisher Biotech | BP362-500 | |
| L-Valine | Sigma | V-6504 | |
| MgCl2 | Fisher Scientifics | FL-06-0303 | |
| Microplate reader Synergy HT | Biotek | Synergy HT | |
| MnCl2 | Sigma | M-9522 | |
| MOPS | Sigma | M1254-1KG | |
| Na2HPO4 | Mallinckrodt | 7892 | |
| NaCl | J.T.Baker | 3624-01 | |
| NaH2PO4 | Mallinckrodt | 7917 | |
| NH4Cl | Sigma | A0171-500G | |
| P-32 radionuclide, orthophosphoric acid in 1 mL water (5 mCi) | Perkin Elmer | NEX053005MC | |
| Storage phosphor screen | Kodak | So230 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 5382000015 | |
| Thiamine | Sigma | T-4625 | |
| TLC PEI Cellulose F | Merk-Millipore | 1.05579.0001 | |
| Tricine | RPI | T2400-500.0 | |
| Typhoon 9400 imager | GE Healthcare | ||
| ZnSO4 | Fisher Scientifics | Z-68 |
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