대장균 (p)ppGpp의 여러 생체 내 측정을위한 마이크로 티터 접시 방사성 라벨링 사용 및 얇은 층 크로마토그래피
Summary
마이크로티터 접시에 방사성 표지된 세균 배양물의 성장은 (p)ppGpp를 포함하여 뉴클레오티드 풀 풍부의 다중 기술적 및 생물학적 복제 측정을 허용하는 높은 처리량 샘플링을 용이하게 합니다. 생리 적 스트레스의 소스에 의해 자극 성장 전환의 효과 뿐만 아니라 스트레스에서 복구 모니터링할 수 있습니다.
Abstract
(p)pppp 뉴클레오티드는 다양한 신체적 및 영양적 스트레스에 반응하여 박테리아에서 글로벌 조절제로서 기능한다. 그것은 GTP 풀의 접근 또는 초과 수준의 축적에 이르게 초, 빠른 발병이있다. 스트레스 반전은 (p)ppGpp의 급속한 실종을 발생, 종종 1 분 미만의 반감기와. (p)ppGpp의 존재는 스트레스의 해로운 영향에 대응하는 세포 유전자 발현 및 신진 대사의 변경으로 이됩니다. 그람 음성 및 그람 양성 박테리아는 서로 다른 반응 메커니즘을 가지고 있지만 둘 다 (p)ppGpp 농도에 의존한다. 어쨌든, 중요한 스트레스 전환 기간 동안 10 초에서 시간까지 다를 수있는 시간 간격으로 많은 방사성 표지 된 박테리아 배양을 동시에 모니터링 할 필요가 있습니다. 이 프로토콜은 이러한 기술적 문제를 해결합니다. 이 방법은 온도 및 셰이커 제어 마이크로 티터 접시 인큐베이터를 활용하여 성장 (흡광도)의 병렬 모니터링및 균일한 인산염 방사성 표지 배양물의 신속한 샘플링을 통해 뉴클레오티드 풀을 해결하고 정량화합니다. PEI 셀룰로오스에 얇은 층 크로마토그래피. 분석의 여러 기술적 및 생물학적 복제에 소량의 샘플이 필요합니다. 이러한 복잡한 성장 전환, 예컨대 급속한 성장 및 급속한 (p)ppGpp 이직률은 이 방법에 의해 정량적으로 평가될 수 있다.
Introduction
(p)ppGpp 제2 메신저는 리보솜 및 아미노산을 합성하기 위한 유전자를 포함하는 다수의 유전자의 발현을 조절하는 글로벌 레귤레이터1,2. 처음에 대장균3에서 발견되었지만 , (p)ppGpp는 식물 엽록체4,5뿐만아니라 그람 양성 및 그램 음성 박테리아 모두에서 발견 될 수 있습니다. 대장균 및 기타 그람 음성 박테리아의 경우,(p)ppGpp는 두 개의 서로다른 부위6,7,8에서RNA 폴리머라제와 직접 상호 작용합니다. 그람 양성에서, (p)ppGpp는 조절9,10으로이어지는 유전자 특이적 DNA 인식 모티프를 가진 GTP 결합 단백질인 CodY에 의해 감지되는 GTP 풍부를 억제한다. (p)ppGpp는 다른 영양소 및 스트레스 조건에 대한 기아에 대한 응답으로 축적되어, 스트레스11,12에적응할 수 있도록 유전자 발현의 느린 성장 및 조정을 초래한다.
축적된 ppGpp의 순량은 합성체와 하이드라아제 활동 사이의 균형을 반영한다. 대장균RelA는 강한 합성이고 SpoT는 강한 하이드로 라제와 약한 합성으로, 각각스트레스 의존적 방식으로 다르게 조절될 수 있는 이중기능성이다. 강한 RelA 합성은 단백질 합성의 요구를 따라가지 못할 때 리보소말 A 부위에 결합된 코돈 지정 충전 tRNA의 가용성이 활성화되는 경우13,14,15. 약한 SpoT (p)ppGpp 합성효소는 강한 (p)ppGpp 하이드로라제는 다른 스트레스 조건 및 다른 메커니즘에 반응하여 억제되는 동안 활성화된다. 몇몇 조건하에서, ACP 또는 Rsd와 같은 단백질은 또한 가수분해와 합성16,17사이 균형을 바꾸는 SpoT에 묶일 수 있습니다. 그람 양성에서, 합성 및 가수 분해는 강한 합성 및 가수 분해 활동뿐만 아니라 작은 하이드로 라제 및 / 또는 합성 12와 단일 RelASpoT 상동체 (RSH) 단백질 사이의 더 복잡한 균형을 반영한다.
(p)ppGpp 뉴클레오티드는 아미노산 기아에 의해 유도된 엄격한 반응 동안 얇은 층 크로마토그램(TLC)의 자가 방사성도에 나타난특이한 32P표지 반점으로 처음 발견되었다 3. 더 자세한 라벨링 프로토콜은 18. 여기서 설명된프로토콜(도 1)은 마이크로티터 플레이트상에서 다중 샘플의 성장을 모니터링할 수 있는 이러한 프로토콜의 수정이다. 이는 (p)ppGpp 풍부도 변화의 여러 생물학적 및 기술적 추정치를 용이하게 하고처음에 19의 디오틱 시프트연구를 위해 개발되었다. (p)ppGpp의 라벨링(p)ppGpp와 32P및 TLC에 의한 검출은 또한 (p)ppGpp 저하율의 측정을 허용한다. (p)ppGpp 수준을 결정하기 위한 대체 방법이 개발되었으며, 이러한 질량 분석법, HPLC20,형광 화학센서21,22,및 GFP 유전자 융합ppPp23에의해 영향을 받는 프로모터에대한, 24. 형광 화학 센서는 현재 ppGpp 를 바인딩 한 후 작은 스펙트럼 이동뿐만 아니라 ppGpp와 pppGpp21을구별하는 문제로 인해 제한된 사용이 있습니다. 이 방법은 시험관 내에서 (p)ppGpp를 검출하는 데 효율적이지만 세포 추출물에서는 검출하지 않는다. HPLC와 관련된 방법은20개 개선되었지만 고가의 장비가 필요하며 높은 스루풋에 잘 적응되지 않았습니다. 마지막으로, GFP 융합은 ppGpp 의존적 활성화 또는 억제의 추정치를 제공할 수 있지만, ppGpp 자체를 측정하지는 않는다. 이러한 대체 방법 각각은 가치가 있지만 값비싼 장비 나 실질적인 실습 시간이 필요하거나 여러 역학 샘플링 및 후속 처리를 수행할 수 없습니다. 여기에 설명된 방법을 통해 96개의 샘플을 약 20분(플레이트당 18개 샘플)에 6개의 TLC 플레이트에 적용할 수 있으며, TLC 개발에 의해 2시간 이내에 해결되며, 라벨링에 따라 몇 시간 또는 하룻밤 후에 얻은 정량적 데이터로 해결됩니다. 강도.
Protocol
Representative Results
Discussion
세포의 거의 균일 한 라벨링을 달성하는 것은이 프로토콜에 대한 중요한 단계입니다. 따라서 MOPS 또는 Tris 매체와 같은 정의된 매체의 사용은 담체 인산염 농도 및 특정 활성의 변이를 허용하는 데 매우 중요합니다. M9 또는 미디어 A와 같은 인산염 버퍼링 된 미디어는 사용할 수 없습니다. 대부분의 정의되지 않은 매체는 LB, 트립톤 및 카자미노산과 같은 가변적인 양의 인산염을 함유하고 있습니다…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 교내 연구 프로그램, 유니스 케네디 슈리버 국립 아동 건강 및 인간 개발 연구소, NIH를 지원했다.
Materials
| (NH4)6(MO7)24 | Fisher Scientifics | A-674 | |
| Autoradiography film | Denville scientific inc. | E3218 | |
| CaCl2 | J.T.Baker | 1-1309 | |
| Chloramphenicol | RPI | C61000-25.0 | |
| CoCl2 | Fisher Scientifics | C-371 | |
| CuSO4 | J.T.Baker | 1843 | |
| FeSO4 | Fisher Scientifics | I-146 | |
| Formic acid | Fisher Biotech | BP1215-500 | |
| Glucose | Macron | 4912-12 | |
| H3BO4 | Macron | 2549-04 | |
| H3PO4 | J.T.Baker | 0260-02 | |
| K2SO4 | Sigma | P9458-250G | |
| KH2PO4 | Fisher Biotech | BP362-500 | |
| L-Valine | Sigma | V-6504 | |
| MgCl2 | Fisher Scientifics | FL-06-0303 | |
| Microplate reader Synergy HT | Biotek | Synergy HT | |
| MnCl2 | Sigma | M-9522 | |
| MOPS | Sigma | M1254-1KG | |
| Na2HPO4 | Mallinckrodt | 7892 | |
| NaCl | J.T.Baker | 3624-01 | |
| NaH2PO4 | Mallinckrodt | 7917 | |
| NH4Cl | Sigma | A0171-500G | |
| P-32 radionuclide, orthophosphoric acid in 1 mL water (5 mCi) | Perkin Elmer | NEX053005MC | |
| Storage phosphor screen | Kodak | So230 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 5382000015 | |
| Thiamine | Sigma | T-4625 | |
| TLC PEI Cellulose F | Merk-Millipore | 1.05579.0001 | |
| Tricine | RPI | T2400-500.0 | |
| Typhoon 9400 imager | GE Healthcare | ||
| ZnSO4 | Fisher Scientifics | Z-68 |
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