Använda Microtiter Dish Radiolabeling för flera in vivo mätningar av Escherichia coli (p) Ppgpp följt av tunn skikts kromatografi
Summary
Tillväxten av radiomärkade bakteriekulturer i mikrotiterrätter underlättar hög genomströmning provtagning som tillåter flera tekniska och biologiska replikat analyser av nukleotid pool överflöd, inklusive den av (p) ppGpp. Effekterna av tillväxt övergångar provoceras av källor till fysiologisk stress samt återhämtning från stress kan övervakas.
Abstract
Den (p) ppGpp nukleotid fungerar som en global regulator i bakterier som svar på en mängd olika fysiska och näringsmässiga stress. Den har en snabb debut, i sekunder, vilket leder till ackumulering av nivåer som närmar sig eller överskrider de av GTP pooler. Stress återföring tillfällen en snabb försvinnande av (p) ppGpp, ofta med en halveringstid på mindre än en minut. Närvaron av (p) ppGpp resulterar i förändringar av cellulära genuttryck och metabolism som motverkar de skadliga effekterna av stress. Gramnegativa och grampositiva bakterier har olika responsmekanismer, men båda är beroende av (p) ppGpp-koncentration. Under alla omständigheter finns det ett behov av att samtidigt övervaka många radiomärkade bakteriekulturer vid tidsintervall som kan variera från 10 sekunder till timmar under kritiska stress övergångsperioder. Detta protokoll tar upp denna tekniska utmaning. Metoden utnyttjar temperatur-och shaker-kontrollerade mikrotiter skålen inkubatorer som möjliggör parallell övervakning av tillväxt (absorbans) och snabb provtagning av enhetligt fosfat-radiomärkade kulturer att lösa och kvantitera nukleotid pooler genom tunn skikts kromatografi på PEI-cellulosa. Små mängder prov behövs för flera tekniska och biologiska replikat av analyser. Komplexa tillväxt övergångar, såsom diauxic tillväxt och Rapid (p) ppGpp omsättningshastighet kan kvantitativt bedömas med denna metod.
Introduction
Den (p) ppgpp andra budbärare är en global regulator som modulerar uttrycket av ett stort antal gener, inklusive gener för syntetisera ribosomer och aminosyror1,2. Även initialt upptäcktes i Escherichia coli3, (p) ppgpp kan hittas i både grampositiva och gramnegativa bakterier samt i växternas kloroplaster4,5. För E. coli och andra gramnegativa bakterier, (p) ppgpp interagerar direkt med RNA-polymeras på två olika platser6,7,8. I grampositiva, (p) ppgpp hämmar GTP överflöd, som är kände av CodY, ett GTP-bindande protein med genspecifika DNA-igenkännings motiv som leder till regel9,10. (p) ppgpp ackumuleras som svar på svält för olika näringsämnen och stressförhållanden, vilket resulterar i långsam tillväxt och justeringar av genuttryck för att möjliggöra anpassning till stress11,12.
Nettobeloppet för ackumulerade ppgpp återspeglar en balans mellan–syntetas och hydrolas verksamhet. I E. coli RelA är en stark–syntetas och SpoT är bifunktionell, med en stark hydrolas och en svag syntetas, som var och en kan regleras på olika sätt i en stress beroende sättet. Den starka RelA-Synthetasen aktiveras när tillgängligheten av Codon-specificerade laddade tRNA som är destinerade till ribosomalen en plats, när den underlåter för att hänga upp med kraven av proteinsyntes13,14,15. Den svaga punkten (p) ppGpp-syntetas aktiveras medan den starka (p) ppGpp-hydrolasen hämmas som svar på andra stressförhållanden och genom andra mekanismer. Under vissa förhållanden, proteiner som ACP eller RSD kan binda till SpoT, som också ändra balansen mellan hydrolys och syntes16,17. I grampositiva speglar syntes och hydrolys en mer komplex balans mellan ett enda RelA-protein med stark syntes och hydrolysverksamhet samt mindre Hydrolaser och/eller synthetaser12.
Den (p) ppGpp nukleotider upptäcktes först som ovanliga 32p märkta fläckar som dök upp på autoradiograms av tunnskiktskromatogram (TLC) under ett strikt svar induceras av aminosyra svält3. Mer detaljerade märkningsprotokoll har granskats 18. Det protokoll som beskrivs här (figur 1) är en modifiering av dessa protokoll som gör det möjligt att övervaka tillväxten av flera prover på mikrotiterplattor. Detta underlättar flera biologiska och tekniska uppskattningar av (p) ppGpp överflöd förändringar och utvecklades ursprungligen för studier av diauxic Skift19. Märkning av (p) ppGpp med 32p och detektion genom TLC medger också mätning av (p) ppgpp nedbrytningshastigheter. Alternativa metoder har utvecklats för att fastställa (p) ppGpp-nivåer såsom masspektrometri, HPLC20, fluorescerande kemosensorer21,22och GFP-genfusioner till projektansvariga som drabbats av ppgpp23, 24. fluorescerande chemosensors har för närvarande en begränsad användning på grund av små spektralskift efter bindande ppgpp samt problem att skilja mellan ppgpp och pppgpp21. Denna metod är effektiv för att upptäcka (p) ppGpp in vitro, men inte i cellulära extrakt. Metoder med HPLC har förbättrats20 men kräver dyr utrustning och är inte väl anpassade till hög genom-put. Slutligen, GFP fusioner kan ge en uppskattning av ppGpp beroende aktivering eller hämning, men inte mäta ppGpp själv. Medan var och en av dessa alternativa metoder är värdefulla, de kräver dyr utrustning eller betydande hands-on tid, eller de är annars inte mottagliga för flera kinetiska provtagning och efterföljande bearbetning. Med den metod som beskrivs här, 96 prover kan appliceras på sex TLC plattor i ca 20 min (18 prover per tallrik), lösas av TLC utveckling på mindre än ett par timmar, med kvantitativa data som erhållits efter flera timmar eller över natten, beroende på märkning Intensitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Att uppnå nära enhetlig märkning av cellerna är ett kritiskt steg för detta protokoll. Därför är användningen av definierade medier, såsom moppar eller Tris media, avgörande för att möjliggöra variation av bärare av fosfat koncentrationer och specifik aktivitet. Fosfatbuffrat media, till exempel M9 eller media A, kan inte användas. De flesta odefinierade medierna innehåller varierande mängder fosfat, såsom LB, trypton och casamino syror. Fosfat isotopen 33p är en svagare EMITTER som kan ers…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöddes av intramural forsknings program, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health och Human Development, NIH.
Materials
| (NH4)6(MO7)24 | Fisher Scientifics | A-674 | |
| Autoradiography film | Denville scientific inc. | E3218 | |
| CaCl2 | J.T.Baker | 1-1309 | |
| Chloramphenicol | RPI | C61000-25.0 | |
| CoCl2 | Fisher Scientifics | C-371 | |
| CuSO4 | J.T.Baker | 1843 | |
| FeSO4 | Fisher Scientifics | I-146 | |
| Formic acid | Fisher Biotech | BP1215-500 | |
| Glucose | Macron | 4912-12 | |
| H3BO4 | Macron | 2549-04 | |
| H3PO4 | J.T.Baker | 0260-02 | |
| K2SO4 | Sigma | P9458-250G | |
| KH2PO4 | Fisher Biotech | BP362-500 | |
| L-Valine | Sigma | V-6504 | |
| MgCl2 | Fisher Scientifics | FL-06-0303 | |
| Microplate reader Synergy HT | Biotek | Synergy HT | |
| MnCl2 | Sigma | M-9522 | |
| MOPS | Sigma | M1254-1KG | |
| Na2HPO4 | Mallinckrodt | 7892 | |
| NaCl | J.T.Baker | 3624-01 | |
| NaH2PO4 | Mallinckrodt | 7917 | |
| NH4Cl | Sigma | A0171-500G | |
| P-32 radionuclide, orthophosphoric acid in 1 mL water (5 mCi) | Perkin Elmer | NEX053005MC | |
| Storage phosphor screen | Kodak | So230 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 5382000015 | |
| Thiamine | Sigma | T-4625 | |
| TLC PEI Cellulose F | Merk-Millipore | 1.05579.0001 | |
| Tricine | RPI | T2400-500.0 | |
| Typhoon 9400 imager | GE Healthcare | ||
| ZnSO4 | Fisher Scientifics | Z-68 |
References
- Cashel, M., Gentry, D., Hernandez, V., Vinella, D. The stringent Response. Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology. , 1458-1489 (1996).
- Magnusson, L. U., Farewell, A., Nyström, T. ppGpp: a global regulator in Escherichia coli. Trends in Microbiology. 13 (5), 236-242 (2005).
- Cashel, M., Gallant, J. Two Compounds implicated in the Function of the RC Gene of Escherichia coli. Nature. 221 (5183), 838-841 (1969).
- Braeken, K., Moris, M., Daniels, R., Vanderleyden, J., Michiels, J. New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology. Trends in Microbiology. 14 (1), 45-54 (2006).
- Atkinson, G. C., Tenson, T., Hauryliuk, V. The RelA/SpoT homolog (RSH) superfamily: distribution and functional evolution of ppGpp synthetases and hydrolases across the tree of life. PloS One. 6 (8), e23479 (2011).
- Mechold, U., Potrykus, K., Murphy, H., Murakami, K. S., Cashel, M. Differential regulation by ppGpp versus pppGpp in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 41 (12), 6175-6189 (2013).
- Molodtsov, V., et al. Allosteric Effector ppGpp Potentiates the Inhibition of Transcript Initiation by DksA. Molecular Cell. 69 (5), 828-839 (2018).
- Ross, W., Sanchez-Vazquez, P., Chen, A. Y. Y., Lee, J. -. H. H., Burgos, H. L. L., Gourse, R. L. L. ppGpp Binding to a Site at the RNAP-DksA Interface Accounts for Its Dramatic Effects on Transcription Initiation during the Stringent Response. Molecular Cell. 62 (6), 811-823 (2016).
- Kriel, A., et al. Direct Regulation of GTP Homeostasis by (p)ppGpp: A Critical Component of Viability and Stress Resistance. Molecular Cell. 48 (2), 231-241 (2012).
- Kriel, A., et al. GTP dysregulation in Bacillus subtilis cells lacking (p)ppGpp results in phenotypic amino acid auxotrophy and failure to adapt to nutrient downshift and regulate biosynthesis genes. Journal of Bacteriology. 196 (1), 189-201 (2014).
- Potrykus, K., Cashel, M. p)ppGpp: still magical. Annual Review of Microbiology. 62, 35-51 (2008).
- Hauryliuk, V., Atkinson, G. C., Murakami, K. S., Tenson, T., Gerdes, K. Recent functional insights into the role of (p)ppGpp in bacterial physiology. Nature Reviews Microbiology. 13 (5), 298-309 (2015).
- Arenz, S., et al. The stringent factor RelA adopts an open conformation on the ribosome to stimulate ppGpp synthesis. Nucleic Acids Research. 44 (13), 6471-6481 (2016).
- Loveland, A. B., et al. Ribosome•RelA structures reveal the mechanism of stringent response activation. eLife. 5, e17029 (2016).
- Brown, A., Fernández, I. S., Gordiyenko, Y., Ramakrishnan, V. Ribosome-dependent activation of stringent control. Nature. 534 (7606), 277-280 (2016).
- Battesti, A., Bouveret, E. Acyl carrier protein/SpoT interaction, the switch linking SpoT-dependent stress response to fatty acid metabolism. Molecular Microbiology. 62 (4), 1048-1063 (2006).
- Lee, J. -. W., Park, Y. -. H., Seok, Y. -. J. Rsd balances (p)ppGpp level by stimulating the hydrolase activity of SpoT during carbon source downshift in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (29), E6845-E6854 (2018).
- Cashel, M. Detection of (p)ppGpp Accumulation Patterns in Escherichia coli mutants. Molecular Microbiology Techniques. 3, 341-356 (1994).
- Fernández-Coll, L., Cashel, M. Contributions of SpoT Hydrolase, SpoT Synthetase, and RelA Synthetase to Carbon Source Diauxic Growth Transitions in Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. , (2018).
- Varik, V., Oliveira, S. R. A., Hauryliuk, V., Tenson, T. HPLC-based quantification of bacterial housekeeping nucleotides and alarmone messengers ppGpp and pppGpp. Scientific Reports. 7 (1), 11022 (2017).
- Rhee, H. -. W., et al. Selective Fluorescent Chemosensor for the Bacterial Alarmone (p)ppGpp. J. Am. Chem. Soc. 130 (3), 784-785 (2008).
- Wang, J., Chen, W., Liu, X., Wesdemiotis, C., Pang, Y. A Mononuclear Zinc Complex for Selective Detection of Diphosphate via Fluorescence ESIPT Turn-On. Journal of Materials Chemistry B. 2 (21), 3349-3354 (2014).
- Pokhilko, A. Monitoring of nutrient limitation in growing E. coli: a mathematical model of a ppGpp-based biosensor. BMC Systems Biology. 11 (1), 106 (2017).
- Funabashi, H., Mie, M., Yanagida, Y., Kobatake, E., Aizawa, M. Fluorescent monitoring of cellular physiological status depending on the accumulation of ppGpp. Biotechnology Letters. 24 (4), 269-273 (2002).
- Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. Culture medium for enterobacteria. Journal of Bacteriology. 119 (3), 736-747 (1974).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Peselis, A., Serganov, A. ykkC riboswitches employ an add-on helix to adjust specificity for polyanionic ligands. Nature Chemical Biology. 14 (9), 887-894 (2018).
- Oki, T., Yoshimoto, A., Sato, S., Takamatsu, A. Purine nucleotide pyrophosphotransferase from Streptomyces morookaensis, capable of synthesizing pppApp and pppGpp. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Enzymology. 410 (2), 262-272 (1975).
- Travers, A. A. ppApp alters transcriptional selectivity of Escherichia coli RNA polymerase. FEBS Letters. 94 (2), 345-348 (1978).
- Bruhn-Olszewska, B., et al. Structure-function comparisons of (p)ppApp vs (p)ppGpp for Escherichia coli RNA polymerase binding sites and for rrnB P1 promoter regulatory responses in vitro. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Gene Regulatory Mechanisms. 1861 (8), 731-742 (2018).
