عزل الخلايا العضلية الفطرية من الغدد الفكه البالغة الدمعية
Summary
الغدة الدمعية (LG) لديها نوعين من الخلايا التعبير عن α-السلس العضلات الاكتين (αsma): الخلايا العضلية (mecs) و pericytes. MECs هي من أصل الجلد ، وجدت في العديد من الانسجه الغديه ، في حين بيريسيلات هي خلايا العضلات الملساء الاوعيه الدموية من أصل باطن الجلد. هذا البروتوكول يعزل MECs و pericytes من murine LGs.
Abstract
الغدة الدمعية (LG) هي غده توبولواسينار التي تفرز طبقه مائية من فيلم المسيل للدموع. تتكون الشجرة الظهاريه من ال جي من اكينار ، الظهاريه الاقنيه ، والخلايا الظهاريه العضلية (MECs). Mecs صريح الفا العضلات الملساء الاكتين (αsma) ولها وظيفة مقلص. وهي موجودة في العديد من الأعضاء الغديه وهي من أصل الجلد الايكولوجي. الاضافه إلى ذلك ، ال جي يحتوي علي SMA + خلايا العضلات الملساء الاوعيه الدموية من أصل اندوجلدي يسمي pericytes: مقلص الخلايا التي مغلف سطح أنابيب الاوعيه الدموية. بروتوكول جديد يسمح لنا لعزل كل من الmecs و pericytes من الكبار murine LGs والغدد فك (SMGs). ويستند البروتوكول علي وضع العلامات الوراثية من MECs و pericytes باستخدام SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/fl الماوس سلاله ، تليها اعداد ال جي تعليق خليه واحده لفرز الخلايا المنشطة فلوري (facs ). يسمح البروتوكول للفصل بين هذه الخلايا اثنين من السكان من أصول مختلفه استنادا إلى التعبير عن جزيء التصاق الخلية الظهاريه (EpCAM) من قبل MECs ، في حين pericytes لا تعبر عن EpCAM. ويمكن استخدام الخلايا المعزولة لزراعه الخلايا أو تحليل التعبير الجيني.
Introduction
الخلايا العضلية (MECs) موجودة في العديد من الغدد الدهنية بما في ذلك الدمعية ، اللعابية ، الحرديريان ، العرق ، البروستاتا ، والثدي. MECs هي نوع الخلية الفريدة التي تجمع بين الظهاريه والنمط الظاهري العضلات الملساء. Mecs اكسبرس α-السلس العضلات الاكتين (SMA) ولها وظيفة مقلص1،2. بالاضافه إلى MECs, الغدة الدمعية (LG) والغدة الفكه (SMG) يحتوي علي خلايا الاوعيه الدموية SMA + تسمي pericytes, وهي خلايا من أصل باطن الجلد التي مغلف سطح أنابيب الاوعيه الدموية3. علي الرغم من mecs و pericytes التعبير عن العديد من علامات ، SMA هو العلامة الوحيدة التي لم يتم التعبير عنها في الأخرى LG و smg الخلايا1،3.
خلال السنوات 40 الماضية ، أفادت عده مختبرات عن اختبارات لتفكك انسجه الغدد الطاردة المختلفة ، والتي تم فيها تطبيق النهج غير الانزيميه والانزيميه. في واحده من التقارير الاولي التي نشرت في 1980 ، ووصف فريتز والمؤلفين المشاركين بروتوكول لعزل نكفي اسيني القطط باستخدام الهضم متسلسلة في محلول كولاجيناز/التريبسين4. في 1989, hann والمؤلفين المشاركين تعديل هذا البروتوكول للعزل اسيني من lgs الفئران باستخدام خليط من كولاجيناز, حمض الهيالورونيك و dnase5. وفي 1990 ، نشرت الشركة العامة للمعاقين وزملاءها طريقه التفكك غير الانزيمي للغده الدمعية اسيني6. في وقت لاحق, في 1998, وعاد الزوكري والمؤلفين المشاركين إلى بروتوكول التفكك الانزيمي لمتابعه Ca2 +-التصوير علي LG و smg معزولة اسيني7. خلال العقد الماضي ، وقد تحولت الباحثين تركيزهم علي عزل الخلايا الجذعية/السلف من الغدد المستبدة. وصفت برينغل والمؤلفين المشاركين بروتوكول في 2011 لعزل الفئران SMG الخلايا الجذعية8. واستندت هذه الطريقة إلى عزل الساليسفيريس التي تحتوي علي الخلايا الجذعية ، والتي كانت محتفظ بها في الثقافة. وادعي أصحاب البلاغ ان تكاثر الخلايا التي تعبر عن العلامات المرتبطة بالخلايا الجذعية يمكن ان يعزل عن هذه الساليسفيريس8. نشرت شاتوس والمؤلفين المشاركين البروتوكول لعزل الخلايا السلف من الفئران البالغين غير المصابين LGs باستخدام الهضم الانزيمي وجمع “المحررة” الخلايا9. في وقت لاحق, في 2015, أكرمان والمؤلفين المشاركين تعديل هذا الاجراء لعزل المفترض “الخلايا الجذعية الغدد الدمعية murine” (“mLGSCs”) التي يمكن نشرها كثقافة أحاديه الطبقة علي عده مقاطع10. ومع ذلك ، لم يسمح اي من الإجراءات المذكورة أعلاه بالتمييز بين الأنواع الفرعية الخلوية والسكان الفرديين للخلايا الظهاريه المعزولة. في 2016 ، نشرت جروبوفا والمؤلفين المشاركين اجراء لعزل الخلايا الجذعية/الprogenitor LG من الكبار murine LGs باستخدام FACS11. ومع ذلك ، لم يكن المقصود هذا البروتوكول لعزل MECs.
في الاونه الاخيره ، لقد أظهرنا اننا قادرون علي عزل SMA + الخلايا من الفئران SMA-GFP القديمة الأسبوع12. ومع ذلك ، في هذا الوقت لم نكن فصل السكان مختلفه من الخلايا SMA +. هنا انشانا اجراء جديد للعزل المباشر لل MECs المتمايزة و pericytes من LGs الكبار و SMGs.
Protocol
Representative Results
Discussion
وصفت هذه المخطوطة بروتوكولا للعزل والعزلة الفوقية من LG و SMG. واستند هذا الاجراء علي وضع العلامات الوراثية من SMA ، الحيوية الوحيدة الموثوقه من MECs و pericytes.
وكان الدافع وراء الحاجة الملحة لوضع هذا البروتوكول هو الغياب التام تقريبا للأدب الذي يسلط الضوء علي عزله MECs من murine LGs و SMGs. ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتور ايفو كالاجزيتش لتزويدنا بسلاله الماوس SMACreErt2 ، تاكيشي umazume لتعقب الماوس والتنميط الجيني ، مارك شيلي للحصول علي صور احترافية لشكل 2. ونشكر أيضا مجلس سكريبس للمحررين العلميين ومارك شيلي للتحرير العلمي للانجليزيه. ونحن ممتنون لمعهد البحوث سكريبس التدفق الخلوي الاساسيه للمساعدة في فرز الخلايا والدكتور روبن ويلينجلب لمناقشات متعددة/المشورة بشان تحليل البيانات FACS.
وقد دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة ، والمنح معهد العين الوطنية 5 R01 EY026202 و 1 R01 EY028983 إلى H.P.M.
Materials
| Biosafety Cabinet | SterilCard Baker | 19669.1 | Class II type A/B3 |
| 10 ml Disposable serological pipets | VWR | 89130-910 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 10 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-908 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 15 mL High-clarity polypropylene conical tubes | Falcon | 352196 | |
| 25 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-900 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 5 mL FACS round-bottom tubes | Fisher Scientific, Falcon | 14-959-11A | |
| 50 mL High-clarity polypropylene conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Antibiotic-antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
| Appropriate filter and non-filter tips | Any available | Any available | |
| BD Insulin Syringes | Becton Dickinson | 328468 | with BD Ultra-Fine needle ½ mL 8 mm 31G |
| BD Syringes 10 mL | Becton Dickinson | 309604 | Sterile |
| Brilliant Violet 421 anti mouse CD326 (EpCAM) | Biolegend | 118225 | Monoclonal Antibody (G8.8) |
| CaCl2 1M solution | BioVision | B1010 | sterile |
| Cell culture dishes 35 mm | Corning | 430165 | Non-pyrogenic, sterile |
| Collagenase Type I | Wortington | LS004194 | |
| Corn oil | Any avaliable | Any avaliable | From grocery store |
| Corning cell strainer size 70 μm | Sigma-Aldrich | CLS431751-50EA | |
| Digital Stirrer PC-410D | Corning | Item# UX-84302-50 | |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693-1G | |
| Dissecting scissors, curved blunt | McKesson Argent | 487350 | Metzenbaum 5-1/2 Inch surgical grade stainless steel non-sterile finger ring handle |
| DNase I | Akron Biotech, catalog number | AK37778-0050 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – low glucose (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5546-500ML | with 1000mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12 (DMEM/F12) | Millipore | DF-042-B | without HEPES, L-glutamine |
| Easypet 3 pipette controller | Eppendorf | 4430000018 | with 2 membrane filters 0.45 µm, 0.1 – 100 mL |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Fisher Vortex Genie 2 | Fisher Scientific | 12-812 | |
| FlowJo version 10 | Any available | Any available | |
| Fluorescence binocular microscope Axioplan2 | Carl Zeiss | ID# 094207 | |
| Ghost Red 780 Viability Dye | Tonbo Biosciences | 13-0865-T100 | |
| GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific, Gibco | 35050061 | |
| Glycerol 99% | Sigma-Aldrich | G-5516 | |
| Hand tally counter | Heathrow Scientific | HEA6594 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma Millipore | H6648-500ML | Modified, with sodium bicarbonate, without calcium chloride, magnesium sulphate, phenol red. |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14025092 | With calcium, magnesium, no phenol red. |
| Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-51B | 02-671-51B |
| HEPES 1M solution | ThermoFisher Scientific, Gibco | 15630-080 | Dilute 1/10 in ddH20 |
| HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | SH3007002E | |
| Hydrochloric Acid (HCl), 5N Volumetric Solution | JT Baker | 5618-03 | To adjust Tris buffer pH |
| Innova 4230 Refrigerated Benchtop Incubator | New Brunswick Scientific | SKU#: | Shaker; 37 °C, 5% CO2 in air |
| Iris scissors | Aurora Surgical | AS12-021 | Pointed tips, delicate, curved, 9 cm, ring handle |
| Isoflurane Inhalation Anesthetic | Southern Anesthesia Surgical (SAS) | PIR001325-EA | |
| MgCl2 1M solution | Sigma-Aldrich | 63069-100ML | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | ThermoFisher Scientific | 3451 | Clear, graduated, sterile |
| Microsoft Power Point | Any available | Any available | |
| NaCl powder | Sigma-Aldrich | S-3014 | |
| Nalgene 25 mm Syringe Filters | Fisher Scientific | 724-2020 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| pH 510 series Benchtop Meter | Oakton | SKU: BZA630092 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 |
| Pure Ethanol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | |
| Red blood cell lysis buffer 10x | BioVision | 5831-100 | |
| Roto-torque Heavy Duty Rotator | Cole Parmer | MPN: 7637-01 | |
| Safe-lock round bottom Eppendorf tubes 2 mL | Eppendorf Biopur | 22600044 | PCR inhibitor, pyrogen and RNAse-free |
| Scissors | Office Depot | 375667 | |
| Sorting flow cytometer MoFlo Astrios EQ | Beckman Coulter | B25982 | With Summit 6.3 software |
| Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002441 | All centrifugation performed at RT |
| Sorvall RT7 Plus Benchtop Refrigerated Centrifuge | Thermo Scientific | ID# 21550 | RTH-750 Rotor. All centrifugation performed at RT |
| Stemi SV6 stereo dissecting microscope | Carl Zeiss | 455054SV6 | With transmitted light base |
| Tamoxifen | Millipore Sigma | T5648-1G | |
| Trizma base powder | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Trypan blue solution | Millipore Sigma | T8154 | |
| Two Dumont tweezers #5 | World Precision Instruments | 500342 | 11 cm, Straight, 0.1 x 0.06 mm tips |
| Upright microscope | Any available | Any available | With transmitted light base |
| Vacuum filtration systems, standard line | VWR | 10040-436 | |
| Variable volume micropipettes | Any available | Any available |
References
- Makarenkova, H. P., Dartt, D. A. Myoepithelial Cells: Their Origin and Function in Lacrimal Gland Morphogenesis, Homeostasis, and Repair. Current Molecular Biology Reports. 1 (3), 115-123 (2015).
- Haaksma, C. J., Schwartz, R. J., Tomasek, J. J. Myoepithelial cell contraction and milk ejection are impaired in mammary glands of mice lacking smooth muscle alpha-actin. Biology Of Reproduction. 85 (1), 13-21 (2011).
- Siedlecki, J., et al. Combined VEGF/PDGF inhibition using axitinib induces alphaSMA expression and a pro-fibrotic phenotype in human pericytes. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. , (2018).
- Fritz, M. E., LaVeau, P., Nahmias, A. J., Weigel, R. J., Lee, F. Primary cultures of feline acinar cells: dissociation, culturing, and viral infection. American Journal of Physiology. 239 (4), G288-G294 (1980).
- Hann, L. E., Tatro, J. B., Sullivan, D. A. Morphology and function of lacrimal gland acinar cells in primary culture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30 (1), 145-158 (1989).
- Cripps, M. M., Bromberg, B. B., Bennett, D. J., Welch, M. H. Structure and function of non-enzymatically dissociated lacrimal gland acini. Current Eye Research. 10 (11), 1075-1080 (1991).
- Zoukhri, D., Hodges, R. R., Rawe, I. M., Dartt, D. A. Ca2+ signaling by cholinergic and alpha1-adrenergic agonists is up-regulated in lacrimal and submandibular glands in a murine model of Sjogren’s syndrome. Clinical Immunology and Immunopathology. 89 (2), 134-140 (1998).
- Pringle, S., Nanduri, L. S., van der Zwaag, M., van Os, R., Coppes, R. P. Isolation of mouse salivary gland stem cells. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Shatos, M. A., Haugaard-Kedstrom, L., Hodges, R. R., Dartt, D. A. Isolation and characterization of progenitor cells in uninjured, adult rat lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2749-2759 (2012).
- Ackermann, P., et al. Isolation and Investigation of Presumptive Murine Lacrimal Gland Stem Cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (8), 4350-4363 (2015).
- Gromova, A., et al. Lacrimal Gland Repair Using Progenitor Cells. Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 88-98 (2017).
- Hawley, D., et al. Myoepithelial cell-driven acini contraction in response to oxytocin receptor stimulation is impaired in lacrimal glands of Sjogren’s syndrome animal models. Scientific Reports. 8 (1), 9919 (2018).
- Matic, I., et al. Quiescent Bone Lining Cells Are a Major Source of Osteoblasts During Adulthood. Stem Cells. 34 (12), 2930-2942 (2016).
- Bond, M. D., Van Wart, H. E. Characterization of the individual collagenases from Clostridium histolyticum. Biochimie. 23 (13), 3085-3091 (1984).
- Eckhard, U., Schonauer, E., Brandstetter, H. Structural basis for activity regulation and substrate preference of clostridial collagenases. G, H, and T. Journal of Biological Chemistry. 288 (28), 20184-20194 (2013).
- Breggia, A. C., Himmelfarb, J. Primary mouse renal tubular epithelial cells have variable injury tolerance to ischemic and chemical mediators of oxidative stress. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 1 (1), 33-38 (2008).
- Mueller, S. O., Clark, J. A., Myers, P. H., Korach, K. S. Mammary gland development in adult mice requires epithelial and stromal estrogen receptor alpha. Endocrinology. 143 (6), 2357-2365 (2002).
- Guthmiller, J. J., Zander, R. A., Butler, N. S. Measurement of the T Cell Response to Preerythrocytic Vaccination in Mice. Methods in Molecular Biology. 1325, 19-37 (2015).
- Seime, T., et al. Inducible cell labeling and lineage tracking during fracture repair. Development, Growth & Differentiation. 57 (1), 10-23 (2015).
- Hawley, D., et al. RNA-Seq and CyTOF immuno-profiling of regenerating lacrimal glands identifies a novel subset of cells expressing muscle-related proteins. PLoS One. 12 (6), e0179385 (2017).
- Tata, A., et al. Myoepithelial Cells of Submucosal Glands Can Function as Reserve Stem Cells to Regenerate Airways after Injury. Cell Stem Cell. 22 (5), 668-683 (2018).
- Song, E. C., et al. Genetic and scRNA-seq Analysis Reveals Distinct Cell Populations that Contribute to Salivary Gland Development and Maintenance. Scientific Reports. 8 (1), 14043 (2018).
- Knight, A. n. d. r. e. w. W., B, N. Distinguishing GFP from cellular autofluorescence. Biophotonics International. 8 (7), 7 (2001).
- Januszyk, M., et al. Evaluating the Effect of Cell Culture on Gene Expression in Primary Tissue Samples Using Microfluidic-Based Single Cell Transcriptional Analysis. Microarrays (Basel). 4 (4), 540-550 (2015).
