Movimiento de shootward de CFDA Tracer cargado en los tejidos de sumidero inferior de Arabidopsis
Summary
El objetivo de este protocolo es mostrar cómo cargar el CFDA en diferentes sitios de las partes inferiores de Arabidopsis. A continuación, presentamos el patrón de distribución resultante de CF en los brotes.
Abstract
El marcador simplástica 5 (6)-carboxyfluorescein diacetato (CFDA) se ha aplicado ampliamente en plantas vivas para demostrar la conexión intercelular, el transporte de floema y los patrones vasculares. Este protocolo muestra el movimiento carboxyfluorescein (CF) de abajo a arriba en la Arabidopsis utilizando el procedimiento de corte de la raíz y del hipocotilo-pinching respectivamente. Estos dos procedimientos diferentes resultan en diferentes eficiencias del movimiento CF: alrededor del 91% de aparición de CF en los brotes con el procedimiento hipocotilo-pinching, mientras que sólo alrededor del 70% de la aparición de la CF con el procedimiento de corte de la raíz. El simple cambio de los sitios de carga, lo que resulta en cambios significativos en la eficiencia móvil de este tinte simplástica, sugiere movimiento CF podría estar sujeto a la regulación simplástica, muy probablemente por la Unión raíz-hipocotilo.
Introduction
Muchos trazadores fluorescentes con una gama de propiedades espectrales, tales como 5 (6)-carboxifluoresceina (CF)1, 8-hidroxiypyrene-1, 3, 6-ácido trisulfónico2, Lucifer Yellow CH (lych)3, Esculin y cter4, se han desarrollado y aplica en plantas para monitorear el movimiento simplásico y la actividad del floema. Generalmente, un tinte simplástica se carga en un corte en el tejido objetivo y la dispersión secuencial del reportero en otras partes de la planta demostrará la comunicación intercelular. Aunque el mecanismo de absorción del tinte no se entiende completamente, el principio subyacente del movimiento CF dentro de las células vivas ha sido ampliamente reconocido. La forma de éster de CF (Diacetato de CF, CFDA) es no fluorescente, pero permeable a la membrana. Esta propiedad permite la rápida difusión de la membrana del tinte en las células. Una vez dentro de las células vivas, las esterasas intracelulares eliminan los grupos de acetato en la posición 3 ‘ y 6 ‘ de CFDA, liberando el CF fluorescente y impermeable a la membrana (figura 1, alternativamente referir a Wright et al.2); El CF puede entonces desplazarse a través de los plasmodesmata a otras partes de las plantas.
Un procedimiento bien establecido con CFDA es que se puede cargar en hojas de origen y se utiliza para monitorear la transmisión de floema y la descarga de floema en los tejidos de fregadero de muchas especies, por ejemplo, como descarga de CF en la raíz de Arabidopsis 5, floema descarga durante la tuberización de patata6, descarga de floema en el fregadero Nicotiana hojas7, y así sucesivamente. Mediante enfoques de carga similares, otros estudios han adoptado este tinte para demostrar la conexión simplástica entre el huésped y el parásito8,9, o para revelar las relaciones simbióticas10,11.
Otra forma de hacer uso de este tinte es cargarlo en celdas específicas o una sola célula por microinyección para determinar su patrón de distribución. Estas técnicas sofisticadas han facilitado en gran medida nuestra comprensión más profunda de la comunicación intercelular mediada por plasmodesmata, particularmente en el desarrollo del concepto de dominio simplástica12,13. Por ejemplo, la microinyección de CFDA en células de cotiledón de Arabidopsis dio como resultado el patrón de acoplamiento de tinte en la epidermis de hipocotilo pero no acoplamiento en las células subyacentes o en la epidermis de la raíz, por lo tanto, la epidermis hipocotilo forma un dominio simplástica14. Dominios similares, tales como las células de la Guardia estomas15, elemento de tamiz-células acompañantes16, células de pelo raíz14 y casquillo de raíz17,18 han sido identificados por la técnica de microinyección. Sorprendentemente, algunos dominios permiten que las moléculas trazadoras se muevan en una dirección determinada. Por ejemplo, tomar el dominio de tricomas, la microinyección de una sonda fluorescente en la célula epidérmica de soporte conduce al flujo de trazador en el dominio de tripeme, sin embargo, la inyección inversa no es verdadera19. Un informe reciente también ha encontrado situaciones similares en los dominios symplásicos del embrión20de Sedum . Por lo tanto, todos los casos anteriores implican que el intercambio de sitios de carga puede conducir a nuevas perspectivas en la comunicación simplástica. Nuestro experimento anterior con el objetivo de diseccionar la ruta del silenciamiento móvil de raíz a disparo identificó un nuevo dominio simplástica, o la zona Hej (Unión hipocotil-epicotilo), que se verificó aún más a través de la carga de la raíz (carga de sumidero no canónico) CFDA experimento21. Aquí, elaboramos aún más el movimiento CF de raíz a disparo usando un método simple y recuperando un potencial dominio simplástica desplazando los sitios de carga. Además, este procedimiento puede ser adaptado para diferenciar los antecedentes genéticos que han alterado el transporte de larga distancia de raíz a brote.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los estudios emergentes han demostrado que las plantas pueden responder rápidamente a los estímulos externos23, incluida la manipulación introducida en los procedimientos experimentales22. En nuestro experimento inicial, nuestra supervisión de este conocimiento a menudo conduce a la falta de manchas. Con estas lecciones, sugerimos que se tengan en cuenta las siguientes precauciones al realizar este experimento: (1) las semillas después de la cosecha deben mantenerse en…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta obra fue financiada por la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (31671257) y el centro de innovación colaborativa de Hubei para la industria del grano (LXT-16-18).
Materials
| KNO3 | Sinopharm Chemical Reagent | 10017218 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10017608 | |
| MgSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10013018 | |
| CaCl2·2H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 20011160 | |
| MnSO4·H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10013418 | |
| Na2MoO4·2H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10019818 | |
| Boric Acid | Sinopharm Chemical Reagent | 10004818 | |
| ZnSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10024018 | |
| CuSO4·5H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10008218 | |
| CoCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10007216 | |
| KI | Sinopharm Chemical Reagent | 10017160 | |
| FeSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10012118 | |
| EDTA | Sinopharm Chemical Reagent | 10009717 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent | 10019718 | |
| KOH | Sinopharm Chemical Reagent | 10017018 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent | 10021418 | |
| Myo-inositol | MACKLIN | I811835 | |
| Nicotinic Acid | MACKLIN | N814565 | |
| Pyridoxine HCl | MACKLIN | V820447 | |
| Thiamine HCl | MACKLIN | T818865 | |
| Glycine | MACKLIN | G800880 | |
| Agar powder | Novon | ZZ14022 | |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | Axio Zoom V16 | |
| Dissecting microscope | SDPTOP | SRE-1030 | |
| 200μl pipette | Dragon Laboratory Instruments | 713111110000-20-200ul | |
| 2.5μl pipette | Eppendorf | 3120000011 | |
| Fine forceps | TWEEZERS | ST-15 | |
| Parafilm | PARAFILM | PM-996 | |
| Stainless steel double-sided blade | Gillette | Platinum-Plus Double-Edge Blade | |
References
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