Scratch Migration Assay et Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing Scratch Migration
Summary
Ici, nous présentons un protocole pour un test de rayure in vitro utilisant les fibroblastes primaires et pour un test de guérison in vivo de blessure de peau chez les souris. Les deux essais sont des méthodes simples pour évaluer la cicatrisation in vitro et in vivo des plaies.
Abstract
La cicatrisation des plaies cutanées est une préoccupation majeure pour les patients souffrant de diabète et pour les personnes âgées, et il est nécessaire d’un traitement efficace. Des approches in vitro et in vivo appropriées sont essentielles pour l’identification de nouvelles molécules cibles pour les traitements médicamenteux afin d’améliorer le processus de guérison des plaies cutanées. Nous avons identifié la sous-unité no 3 des canaux calciques à rayons de tension (Cav-3) comme une molécule cible potentielle pour influencer la cicatrisation des plaies dans deux essais indépendants, c’est-à-dire l’analyse de migration des rayures in vitro et le modèle de chambre de pli de peau dorsal in vivo. Fibroblastes embryonnaires primaires de souris (MEFs) aiguement isolés des souris sauvages (WT) et Cav 3-déficientes (Cav3KO) ou fibroblastes aiguement isolés des souris de WT traitées avec siRNA pour réguler vers le bas l’expression du gène de Cacnb3 , l’encodage Cav3,ont été utilisés. Une égratignure a été appliquée sur une monocouche de cellules confluentes et la fermeture d’écart a été suivie en prenant des images microscopiques aux points de temps définis jusqu’à repeupler complètement l’écart par les cellules migrantes. Ces images ont été analysées, et le taux de migration cellulaire a été déterminé pour chaque condition. Dans un analyse in vivo, nous avons implanté une chambre de pli de peau dorsal sur des souris WT et Cav3 KO, appliqué une plaie circulaire définie de 2 mm de diamètre, couvert la plaie avec un couvercle en verre pour la protéger contre les infections et la dessiccation, et surveillé la fermeture macroscopique de la plaie au fil du temps. La fermeture des plaies était significativement plus rapide chez les souris cicnb3-gène-déficientes. Étant donné que les résultats des essais in vivo et in vitro sont bien corrélés, l’analyse in vitro peut être utile pour le dépistage à haut débit avant de valider les coups in vitro par le modèle de guérison des plaies in vivo. Ce que nous avons montré icipour les souris ou les cellules de type sauvage et cav3-déficients pourrait également être applicable pour des molécules spécifiques autres que Cav3.
Introduction
La cicatrisation des plaies cutanées commence immédiatement après la blessure cutanée afin de restaurer l’intégrité de la peau et de protéger l’organisme contre les infections. Le processus de cicatrisation des plaies passe par quatre phases qui se chevauchent; coagulation, inflammation, nouvelle formation de tissu, et tissu transformant1. La migration cellulaire est cruciale pendant ces phases. Les cellules inflammatoires, les cellules immunitaires, les kératinocytes, les cellules endothéliales et les fibroblastes sont activés à différents moments et envahissent la zone de la plaie2. Les méthodes d’enquête sur la cicatrisation des plaies in vitro et in vivo sont d’un grand intérêt non seulement pour comprendre les mécanismes sous-jacents, mais aussi pour tester de nouveaux médicaments et pour développer de nouvelles stratégies visant à améliorer et à accélérer la cicatrisation des plaies cutanées.
Pour surveiller et analyser la migration cellulaire, l’analyse de la migration des rayures peut être utilisée. On l’appelle souvent l’in vitro, l’invitro, comme l’exemple de guérison des plaies. Cette méthode nécessite une installation de culture cellulaire3. Il s’agit d’une procédure simple, il n’y a pas besoin d’équipement haut de gamme et l’analyse peut être effectuée dans la plupart des laboratoires de biologie cellulaire. Dans cet analyse, une zone sans cellules est créée par la perturbation mécanique d’une monocouche cellulaire confluente, de préférence des cellules ou des fibroblastes épithélials ou endothéliaux. Les cellules sur le bord de l’éraflure migreront afin de repeupler l’espace créé. La quantification de la diminution de la zone exempte de cellules au fil du temps ressemble au taux de migration et indique le temps dont les cellules ont besoin pour combler l’écart. À cette fin, les chercheurs peuvent utiliser soit des cellules très isolées de souris WT ou des souris dépourvues d’un gène d’intérêt4, ou des cellules immortalisées disponibles à partir de dépôts cellulaires fiables. L’exemple de rayure permet d’étudier l’influence des composés pharmacologiquement actifs ou l’effet des CDNA ou des siARN transfectés sur la migration cellulaire.
In vivo, la cicatrisation des plaies est un processus physiologique complexe, nécessitant différents types de cellules, y compris les kératinocytes, les cellules inflammatoires, les fibroblastes, les cellules immunitaires et les cellules endothéliales afin de restaurer l’intégrité physique de la peau aussi rapidement que possible1 . Différentes méthodes pour étudier la cicatrisation in vivo des plaies ont été développées et utilisées au cours des5,6,7,8. La chambre de skinfold dorsal décrite dans cet article a été précédemment employée pour des essais de guérison de blessure9. Il est utilisé comme une préparation de chambre de skinfold dorsal modifiée pour des souris. Le modèle de chambre peau replié modifié présente plusieurs avantages. 1) il minimise la contraction de peau, qui empêche d’observer le processus de guérison de blessure et pourrait influencer la réparation de blessure chez les souris. 2) Cette chambre fait usage de couvrir la plaie avec un couvercle en verre, réduisant des infections de tissu et dessiccation, qui pourrait retarder le processus de guérison. 3) Le flux sanguin et la vascularisation peuvent être directement surveillés. 4) Il permet l’application topique répétitive des composés pharmacologiquement actifs et des réactifs afin de traiter la blessure et d’accélérer la guérison9,10.
Nous avons identifié la sous-unité no 3 des canaux calciques à haute tension (Cav-3) comme une molécule cible potentielle pour influencer la cicatrisation des plaies cutanées à l’aide de deux protocoles indépendants, c’est-à-dire l’analyse de migration des rayures in vitro et le modèle de chambre de pli de peau dorsal in vivo. Pour l’évaluation in vitro, nous avons utilisé des fibroblastes primaires, ces cellules expriment le gène Cacnb3 codant la protéine Cav3, mais manquent d’afflux De Ca2 ou de courants Ca2 dépendants de la tension. Nous avons décrit une nouvelle fonction de Cav-3 dans ces fibroblastes : Cav-3 se lie au récepteur inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3R) et les contraintes de libération de calcium du réticulum endoplasmique. La suppression du gène Cacnb3 chez la souris conduit à une sensibilité accrue de l’IP3R pour IP3, la migration cellulaire améliorée et la réparation accrue des plaies cutanées4.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce manuscrit, nous décrivons un analyse de guérison in vitro et in vivo de blessure et corrélons les résultats obtenus. Pour l’analyse in vitro, nous avons utilisé les fibroblastes primaires de souris4,14,15 qui jouent un rôle important dans la cicatrisation des plaies et le remodelage des tissus11. D’autres types de cellules adhérentes qui poussent sous forme de monocouches (p. ex. cellules ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions la Dre Petra Weissgerber et l’Unité Transgène de l’établissement animalier SPF (projet P2 de la SFB 894) de la Faculté de médecine et l’établissement animalier de l’Institut de chirurgie clinique et expérimentale de la Faculté de médecine de l’Université de Sarre, à Hombourg. Nous remercions le Dr Andreas Beck pour la lecture critique du manuscrit. Cette étude a été financée par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Sonderforschungsbereich (SFB) 894, projet A3 à A.B. et V.F.).
Materials
| 0.9 % NaCl | |||
| 1 ml syringes | BD Plastipak | 303172 | |
| 6 well plate | Corning | 3516 | |
| Biopsy punch | Kai Industries | 48201 | 2 mm |
| Cacnb3 Mouse siRNA Oligo Duplex (Locus ID 12297) | Origene | SR415626 | |
| Depilation cream | any depilation cream | ||
| Dexpanthenol 5% (BEPANTHEN) | Bayer | 3400935940179.00 | (BEPANTHEN) |
| Dihydroxylidinothiazine hydrochloride (Xylazine) | Bayer Health Care | Rompun 2% | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco by life technologies | 41966-029 | |
| Fetal bovine serum | Gibco by life technologies | 10270-106 | |
| Hexagon full nut | |||
| Ketamine hydrochloride | Zoetis | KETASET | |
| Light microscope | Keyence, Osaka, Japan | BZ-8000 | Similar microscopes might be used |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 13778075 | |
| Micro-forceps | |||
| Micro-Scissors | |||
| Mouse restrainer | Home-made | ||
| Normal scissors | |||
| Objective | Nikon | plan apo 10x/0.45 | |
| Opti-MEM | Gibco by life technologies | 51985-026 | |
| Polypropylene sutures | |||
| Screwdriver | |||
| Skin disinfectant (octeniderm) | Schülke & Mayr GmbH | 118212 | |
| Slotted cheese head screw | |||
| Snap ring | |||
| Snap ring plier | |||
| Surgical microscope with camera | Leica | Leica M651 | |
| Titanium frames for the skinfold chamber | IROLA | 160001 | Halteblech M |
| Wire piler |
References
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