JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Génétique

اختبار لتحديد كمية البروتين-RNA الربط في البكتيريا

Published: June 12, 2019
doi:
10.3791/59611
, , , ,
1Department of Biotechnology and Food Engineering,Technion-Israel Institute of Technology, 2Russell Berrie Nanotechnology Institute,Technion-Israel Institute of Technology

Summary

في هذه الطريقة، نقوم بتحديد التقارب الملزم للبروتينات الملزمة الحمض النووي الريبي (RBPs) إلى مواقع ربط الكُونات وغير الكونيات باستخدام اختبار مراسل بسيط ومباشر في الخلايا البكتيرية. ويستند هذا القول على قمع جين مراسل.

Abstract

في خطوة بدء ترجمة البروتين، يرتبط الريبوسم بمنطقة بدء mRNA. يمكن حظر بدء الترجمة عن طريق ربط بروتين ملزم الحمض النووي الريبي (RBP) إلى منطقة بدء mRNA، الذي يتداخل مع ربط ريبوسم. في الطريقة المعروضة، نستخدم هذه الظاهرة حجب لتحديد مدى التقارب ملزمة من RBPs إلى مواقعها ملزمة cognate وغير cognate. للقيام بذلك، نقوم بإدراج موقع ربط اختبار في منطقة بدء mRNA مراسل والحث على التعبير عن RBP الاختبار. وفي حالة ربط RBP-RNA، لاحظنا قمعاً السينياً للتعبير الصحفي كدالة لتركيز الممارسات التجارية التقييدية. وفي حالة عدم وجود تقارب أو تقارب منخفض جداً بين الموقع الملزم والممارسات التجارية التقييدية، لم يلاحظ أي قمع كبير. يتم تنفيذ هذه الطريقة في الخلايا البكتيرية الحية، ولا تتطلب آلات مكلفة أو متطورة. ومن المفيد تحديد الخصائص والمقارنة بين أوجه التقارب الملزمة لمختلف الممارسات التجارية التقييدية التي تعمل في البكتيريا إلى مجموعة من مواقع الربط المصممة. قد يكون هذا الأسلوب غير مناسب للمواقع الملزمة ذات التعقيد الهيكلي العالي. ويرجع ذلك إلى إمكانية قمع بدء ريبوسومال من قبل هيكل MRNA معقدة في غياب RBP، مما يؤدي إلى التعبير الجيني مراسل القاعدية أقل، وبالتالي قمع مراسل أقل ملاحظة على ربط RBP.

Introduction

وقد تمت دراسة اللوائح القائمة على البروتين الملزم للRNA (RBP) بعد النسخ، وعلى وجه التحديد توصيف التفاعل بين الممارسات التجارية التقييدية والحمض النووي الريبي، على نطاق واسع في العقود الأخيرة. هناك أمثلة متعددة من التنظيم أسفل الترجمة في البكتيريا الناشئة من RBPs تثبيط،أو تتنافس مباشرة مع، الريبوسم ملزمة 1،2،3. في مجال البيولوجيا التركيبية، تظهر تفاعلات RBP-RNA كأداة هامة لتصميم الدوائر الوراثية المستندة إلى النسخ4و5. ولذلك، هناك زيادة في الطلب على توصيف هذه التفاعلات بين الممارسات التجارية التقييدية والحمض النووي الريبي في سياق خلوي.

الطرق الأكثر شيوعا لدراسة التفاعلات البروتين الحمض النووي الريبي هي تحويل التنقل الكهربائي (EMSA)6، والذي يقتصر على إعدادات المختبر ، ومختلف الاختبارات المنسدلة7، بما في ذلك طريقة CLIP8،9 . في حين أن هذه الأساليب تمكن من اكتشاف مواقع الربط الحمض النووي الريبي دي نوفو, أنها تعاني من عيوب مثل بروتوكولات كثيفة العمالة وردود الفعل التسلسل العميق مكلفة وقد تتطلب جسم اضدي معين لRBP المنسدلة. بسبب الطبيعة القابلة للتأثر من الحمض النووي الريبي لبيئتها، يمكن أن تؤثر عوامل كثيرة على تفاعلات RBP-RNA، مع التأكيد على أهمية استجواب RBP-RNA ملزمة في السياق الخلوي. على سبيل المثال، لقد أظهرنا نحن وآخرون اختلافات كبيرة بين هياكل الحمض النووي الريبي في الجسم الحي وفي المختبر10،11.

استنادا ً إلى نهج دراسة سابقة12، أظهرنا مؤخرا10 أنه عند وضع مواقع ملزمة مصممة مسبقا للRBPs كابسيد من البكتيريا GA13، MS214، PP715، وQβ16 في ترجمة بداية منطقة من مراسلة [مرنا], مراسلة قمعت تعبير بقوّة. نحن نقدم طريقة بسيطة وكمية نسبيا، استنادا إلى هذه الظاهرة القمع، لقياس التقارب بين RBPs وما يقابلها RNA موقع ملزمs في الجسم الحي.

Protocol

1. إعداد النظام تصميم بلازميدات الموقع الملزم تصميم شريط كاسيت موقع الربط كما هو موضح في الشكل 1. كل المينيجين يحتوي على الأجزاء التالية (5′ إلى 3′): Eagl موقع تقييد، و40 قواعد من 5 ‘ نهاية كانامايسين (كان) الجينات المقاومة، pLac-Ara المروج، موقع ربط ريبوسم (RBS)، AUG من …

Representative Results

تستخدم الطريقة المعروضة المنافسة بين RBP والريبوسوم لربط جزيءmRNA (الشكل 1). وتنعكس هذه المنافسة من خلال انخفاض مستويات mCherry كدالة لزيادة إنتاج RBP-mCerulean، وذلك بسبب زيادة تركيزات المحفز. في حالة زيادة الفلورة mCerulean، مع عدم وجود تغييرات كبيرة في mCherry، يتم استنتاج…

Discussion

الطريقة الموصوفة في هذه المقالة يسهل القياس الكمي في الجسم الحي من تقارب ربط RBP-RNA في خلايا القولونية E. والبروتوكول سهل نسبيا ويمكن إجراؤه دون استخدام آلية متطورة، وتحليل البيانات واضح. وعلاوة على ذلك، تُنتج النتائج على الفور، دون وقت الانتظار الطويل نسبيا المرتبط بنتائج الجيل التال?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وقد تلقى هذا المشروع تمويلا ً من برنامج I-CORE التابع للجنة التخطيط والميزنة ومؤسسة العلوم الإسرائيلية (المنحة رقم 152/11)، والمنحة رقم ماري كوري لإعادة الإدماج. PCIG11-GA- 2012-321675، ومن برنامج أبحاث وابتكار أفق 2020 التابع للاتحاد الأوروبي بموجب اتفاقية المنحة رقم 664918 – MRG-Grammar.

Materials

Ampicillin sodium salt SIGMA A9518
Magnesium sulfate (MgSO4) ALFA AESAR 33337
48 plates Axygen P-5ML-48-C-S
8- lane plates Axygen RESMW8I
96-well plates Axygen P-DW-20-C
96-well plates for plate reader Perkin Elmer 6005029
ApaLI NEB R0507
Binding site sequences Gen9 Inc. and Twist Bioscience see Table 1
E. coli TOP10 cells Invitrogen C404006
Eagl-HF NEB R3505
glycerol BIO LAB 071205
incubator TECAN liconic incubator
Kanamycin solfate SIGMA K4000
KpnI- HF NEB R0142
ligase NEB B0202S
liquid-handling robotic system TECAN EVO 100, MCA 96-channel
Matlab analysis software Mathworks
multi- pipette 8 lanes Axygen BR703710
N-butanoyl-L-homoserine lactone (C4-HSL) cayman K40982552 019
PBS buffer Biological Industries 020235A
platereader TECAN Infinite F200 PRO
Q5 HotStart Polymerase NEB M0493
RBP seqeunces Addgene 27121 & 40650 see Table 2
SODIUM CHLORIDE (NaCL) BIO LAB 190305
SV Gel and PCR Clean-Up System Promega A9281
Tryptone BD 211705
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cerretti, D. P., Mattheakis, L. C., Kearney, K. R., Vu, L., Nomura, M. Translational regulation of the spc operon in Escherichia coli. Identification and structural analysis of the target site for S8 repressor protein. Journal of Molecular Biology. 204 (2), 309-329 (1988).
  2. Babitzke, P., Baker, C. S., Romeo, T. Regulation of translation initiation by RNA binding proteins. Annual Review of Microbiology. 63, 27-44 (2009).
  3. Van Assche, E., Van Puyvelde, S., Vanderleyden, J., Steenackers, H. P. RNA-binding proteins involved in post-transcriptional regulation in bacteria. Frontiers in Microbiology. 6, 141 (2015).
  4. Chappell, J., Watters, K. E., Takahashi, M. K., Lucks, J. B. A renaissance in RNA synthetic biology: new mechanisms, applications and tools for the future. Current Opinion in Chemical Biology. 28, 47-56 (2015).
  5. Wagner, T. E., et al. Small-molecule-based regulation of RNA-delivered circuits in mammalian cells. Nature Chemical Biology. 14 (11), 1043 (2018).
  6. Bendak, K., et al. A rapid method for assessing the RNA-binding potential of a protein. Nucleic Acids Research. 40 (14), e105 (2012).
  7. Strein, C., Alleaume, A. -. M., Rothbauer, U., Hentze, M. W., Castello, A. A versatile assay for RNA-binding proteins in living cells. RNA. 20 (5), 721-731 (2014).
  8. Ule, J., Jensen, K. B., Ruggiu, M., Mele, A., Ule, A., Darnell, R. B. CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain. Science. 302 (5648), 1212-1215 (2003).
  9. Lee, F. C. Y., Ule, J. Advances in CLIP Technologies for Studies of Protein-RNA Interactions. Molecular Cell. 69 (3), 354-369 (2018).
  10. Katz, N., et al. An in Vivo Binding Assay for RNA-Binding Proteins Based on Repression of a Reporter Gene. ACS Synthetic Biology. 7 (12), 2765-2774 (2018).
  11. Watters, K. E., Yu, A. M., Strobel, E. J., Settle, A. H., Lucks, J. B. Characterizing RNA structures in vitro and in vivo with selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq). Methods. 103, 34-48 (2016).
  12. Saito, H., et al. Synthetic translational regulation by an L7Ae-kink-turn RNP switch. Nature Chemical Biology. 6 (1), 71-78 (2010).
  13. Gott, J. M., Wilhelm, L. J., Uhlenbeck, O. C. RNA binding properties of the coat protein from bacteriophage GA. Nucleic Acids Research. 19 (23), 6499-6503 (1991).
  14. Peabody, D. S. The RNA binding site of bacteriophage MS2 coat protein. The EMBO Journal. 12 (2), 595-600 (1993).
  15. Lim, F., Peabody, D. S. RNA recognition site of PP7 coat protein. Nucleic Acids Research. 30 (19), 4138-4144 (2002).
  16. Lim, F., Spingola, M., Peabody, D. S. The RNA-binding Site of Bacteriophage Qβ Coat Protein. Journal of Biological Chemistry. 271 (50), 31839-31845 (1996).
  17. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  18. . Optimizing Restriction Endonuclease Reactions Available from: https://international.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/optimizing-restriction-endonuclease-reactions (2018)
  19. . Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System Protocol Available from: https://worldwide.promega.com/resources/protocols/technical-bulletins/101/wizard-sv-gel-and-pcr-cleanup-system-protocol/ (2018)
  20. . Ligation Protocol with T4 DNA Ligase (M0202) Available from: https://international.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-with-t4-dna-ligase-m0202 (2018)
  21. . Routine Cloning Using Top10 Competent Cells – US Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cloning/competent-cells-protocol/routine-cloning-using-top10-competent-cells.html (2018)
  22. . NucleoSpin Plasmid – plasmid Miniprep kit Available from: https://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/DNAandRNApurification/PlasmidDNApurificationeasyfastreliable/NucleoSpinPlasmidplasmidMiniprepkit/tabid/1379/language/en-US/Default.aspx (2018)
  23. Sanger, F., Coulson, A. R., Barrell, B. G., Smith, A. J. H., Roe, B. A. Cloning in single-stranded bacteriophage as an aid to rapid DNA sequencing. Journal of Molecular Biology. 143 (2), 161-178 (1980).
  24. . Protocol – How to Create a Bacterial Glycerol Stock Available from: https://www.addgene.org/protocols/create-glycerol-stock/ (2018)
  25. . Making your own chemically competent cells Available from: https://international.neb.com/protocols/2012/06/21/making-your-own-chemically-competent-cells (2018)
  26. . Luria-Bertani (LB) Medium Preparation · Benchling Available from: https://benchling.com/protocols/gdD7XI0J/luria-bertani-lb-medium-preparation (2018)
  27. Delebecque, C. J., Silver, P. A., Lindner, A. B. Designing and using RNA scaffolds to assemble proteins in vivo. Nature Protocols. 7 (10), 1797-1807 (2012).
  28. Hocine, S., Raymond, P., Zenklusen, D., Chao, J. A., Singer, R. H. Single-molecule analysis of gene expression using two-color RNA labeling in live yeast. Nature Methods. 10 (2), 119-121 (2013).
  29. Espah Borujeni, A., et al. Precise quantification of translation inhibition by mRNA structures that overlap with the ribosomal footprint in N-terminal coding sequences. Nucleic Acids Research. 45 (9), 5437-5448 (2017).
  30. Ding, Y., et al. In vivo genome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatory features. Nature. 505, (2013).
  31. Rouskin, S., Zubradt, M., Washietl, S., Kellis, M., Weissman, J. S. Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo. Nature. 505 (7485), 701-705 (2014).
  32. Lucks, J. B., et al. Multiplexed RNA structure characterization with selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), 11063-11068 (2011).
  33. Spitale, R. C., et al. Structural imprints in vivo decode RNA regulatory mechanisms. Nature. 519 (7544), 486 (2015).
  34. Watters, K. E., Abbott, T. R., Lucks, J. B. Simultaneous characterization of cellular RNA structure and function with in-cell SHAPE-Seq. Nucleic Acids Research. 44 (2), e12 (2016).
  35. Flynn, R. A., et al. Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE. Nature Protocols. 11 (2), 273-290 (2016).
  36. Bernardi, A., Spahr, P. -. F. Nucleotide Sequence at the Binding Site for Coat Protein on RNA of Bacteriophage R17. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69 (10), 3033-3037 (1972).

Tags

Keywords: Protein-RNA BindingRNA Binding ProteinRBP-RNA AffinityIn VivoPlasmid DesignBinding Site CassetteMCherry Reporter GeneRBP SequenceBacterial TransformationGlycerol Stocks
check_url/fr/59611?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Katz, N., Cohen, R., Atar, O., Goldberg, S., Amit, R. An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria. J. Vis. Exp. (148), e59611, doi:10.3791/59611 (2019).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image