En analyse til kvantificering af protein-RNA-binding i bakterier

Summary

I denne metode kvantificerer vi binding affiniteten af RNA bindende proteiner (RBPs) til at cognate og ikke-cognate bindingssteder ved hjælp af en simpel, levende, reporter assay i bakterieceller. Analysen er baseret på undertrykkelse af et reporter-gen.

Abstract

I indledningen af protein oversættelsen binder ribosom sig til Initierings området for mRNA. Initiering af oversættelse kan blokeres ved binding af et RNA-bindingsprotein (RBP) til Initierings området for mRNA, som forstyrrer ribosom-binding. I den præsenterede metode udnytter vi dette blokerende fænomen til at kvantificere den bindende affinitet af RBPs til deres cognate og ikke-cognate bindingssteder. For at gøre dette indsætter vi et test bindingssted i Initierings området for en reporter mRNA og inducerer ekspression af testen RBP. I tilfælde af RBP-RNA-binding observerede vi en sigmoidal undertrykkelse af journalistens udtryk som en funktion af RBP-koncentrationen. I tilfælde af manglende affinitet eller meget lav affinitet mellem bindingssted og RBP blev der ikke observeret nogen signifikant undertrykkelse. Metoden udføres i levende bakterieceller og kræver ikke dyre eller sofistikerede maskiner. Det er nyttigt til at kvantificere og sammenligne mellem de bindende tilhørsforhold af forskellige RBPs, der er funktionelle i bakterier til et sæt af designede bindingssteder. Denne metode kan være uhensigtsmæssig for bindingssteder med høj strukturel kompleksitet. Dette skyldes muligheden for undertrykkelse af ribosomale initiering ved kompleks mRNA struktur i fravær af RBP, hvilket ville resultere i lavere basal reporter genekspression, og dermed mindre observerbare reporter undertrykkelse ved RBP binding.

Introduction

RNA binding protein (RBP)-baseret post-transkriptional regulering, specifikt karakterisering af samspillet mellem RBPs og RNA, er blevet undersøgt udførligt i de seneste årtier. Der er flere eksempler på translationel Nedregulering i bakterier, som stammer fra rbps-hæmmende eller direkte konkurrerer med ribosom-bindingen^1,2,3. Inden for syntetisk biologi er der opstået RBP-RNA-interaktioner som et vigtigt redskab til design af transkriptionsbaserede genetiske kredsløb^4,5. Derfor er der en stigning i efterspørgslen efter karakterisering af sådanne RBP-RNA interaktioner i en cellulær sammenhæng.

De mest almindeligt forekommende metoder til undersøgelse af protein-RNA-interaktioner er elektroforetic Mobility Shift assay (EMSA)⁶, som er begrænset til in vitro-indstillinger, og forskellige pull-down assays⁷, herunder Clip-metoden^8,9 . Selv om sådanne metoder muliggør opdagelsen af de Novo RNA-bindingssteder, lider de af ulemper såsom arbejdsintensive protokoller og dyre dybe sekvensering reaktioner og kan kræve et specifikt antistof for RBP pull-down. På grund af den modtagelige karakter af RNA til sit miljø, mange faktorer kan påvirke RBP-RNA interaktioner, understreger vigtigheden af at forhør RBP-RNA binding i cellulære kontekst. For eksempel har vi og andre vist signifikante forskelle mellem RNA-strukturer in vivo og in vitro^10,11.

Baseret på tilgangen i en tidligere undersøgelse¹², vi for nylig demonstreret¹⁰ , at når du placerer pre-designede bindingssteder for kapsid rbps fra Bakteriofager GA¹³, MS2¹⁴, PP7¹⁵, og qβ¹⁶ i oversættelses Initierings området for en reporter mRNA, reporter Expression er stærkt undertrykt. Vi præsenterer en forholdsvis enkel og kvantitativ metode, der er baseret på dette undertrykkelses fænomen, til at måle affiniteten mellem RBPs og deres tilsvarende RNA-bindingssted in vivo.

Protocol

1. klargøring af systemet Design af binding-site plasmider Design den indbindingsside kassette, som er afbildet i figur 1. Hvert mini gen indeholder følgende dele (5 ‘ til 3 ‘): eagl restriktion site, ∼ 40 baser af 5 ‘ enden af kanamycin (kan) modstands genet, pLac-Ara Promoter, ribosom bindingssted (RBS), aug af mcherry genet, et spacer (δ), en RBP binding site, 80 baser af 5 ‘ ende af mCherry-genet og et ApaLI-begrænsnings sted.Bemærk…

Representative Results

Den præsenterede metode udnytter konkurrencen mellem en RBP og ribosom til binding til mRNA molekyle (figur 1). Denne konkurrence afspejles af faldende mCherry niveauer som en funktion af øget produktion af RBP-mCerulean, på grund af stigende koncentrationer af inducer. I tilfælde af øget mCerulean fluorescens, uden væsentlige ændringer i mCherry, udledes en mangel på RBP binding. Repræsentative resultater for både en positiv og en negativ stamme er…

Discussion

Den metode, der er beskrevet i denne artikel, letter kvantitativ in vivo-måling af RBP-RNA-bindingsaffinitet i E. coli -celler. Protokollen er forholdsvis let og kan gennemføres uden brug af sofistikerede maskiner, og dataanalyse er ligetil. Desuden, resultaterne er produceret straks, uden den relativt lange ventetid i forbindelse med næste generation sekventering (NGS) resultater.

En begrænsning til denne metode er, at det kun virker i bakterieceller. En tidligere undersøgelse<s…

Materials

Ampicillin sodium salt	SIGMA	A9518
Magnesium sulfate (MgSO4)	ALFA AESAR	33337
48 plates	Axygen	P-5ML-48-C-S
8- lane plates	Axygen	RESMW8I
96-well plates	Axygen	P-DW-20-C
96-well plates for plate reader	Perkin Elmer	6005029
ApaLI	NEB	R0507
Binding site sequences	Gen9 Inc. and Twist Bioscience		see Table 1
E. coli TOP10 cells	Invitrogen	C404006
Eagl-HF	NEB	R3505
glycerol	BIO LAB	071205
incubator	TECAN	liconic incubator
Kanamycin solfate	SIGMA	K4000
KpnI- HF	NEB	R0142
ligase	NEB	B0202S
liquid-handling robotic system	TECAN	EVO 100, MCA 96-channel
Matlab analysis software	Mathworks
multi- pipette 8 lanes	Axygen	BR703710
N-butanoyl-L-homoserine lactone (C4-HSL)	cayman	K40982552 019
PBS buffer	Biological Industries	020235A
platereader	TECAN	Infinite F200 PRO
Q5 HotStart Polymerase	NEB	M0493
RBP seqeunces	Addgene	27121 & 40650	see Table 2
SODIUM CHLORIDE (NaCL)	BIO LAB	190305
SV Gel and PCR Clean-Up System	Promega	A9281
Tryptone	BD	211705