박테리아에서 단백질 RNA 결합을 정량화하기위한 분석
Summary
이 방법에서, 우리는 세균 세포에서 단순, 살아있는, 리포터 분석법을 사용하여 동축 및 비동종 결합 부위에 RNA 결합 단백질(RBPs)의 결합 친화도를 정량화한다. 분석은 기자 유전자의 억압에 근거를 둔다.
Abstract
단백질 번역의 개시 단계에서, 리보솜은 mRNA의 개시 부위에 결합한다. 번역 개시는 리보솜 결합을 방해하는 mRNA의 개시 지구에 RNA 결합 단백질 (RBP)의 결합에 의해 차단될 수 있습니다. 제시된 방법에서는, 우리는 그들의 동체 및 비 cognate 결합 사이트에 대한 RP의 결합 친화도를 정량화하기 위해 이 차단 현상을 이용한다. 이를 위해, 우리는 리포터 mRNA의 개시 부위에 시험 결합 부위를 삽입하고 시험 RBP의 발현을 유도한다. RBP-RNA 결합의 경우, 우리는 RBP 농도의 함수로서 리포터 발현의 시그노이드 억압을 관찰했다. 결합 부위와 RBP 사이의 친화성 또는 매우 낮은 친화력의 경우, 유의한 억압이 관찰되지 않았다. 이 방법은 살아있는 세균 세포에서 수행되며 비싸거나 정교한 기계가 필요하지 않습니다. 박테리아에서 기능하는 상이한 RP의 결합 친화도를 설계된 결합 부위세트에 정량화하고 비교하는 데 유용합니다. 이 방법은 구조적 복잡성이 높은 사이트를 바인딩하는 데 적합하지 않을 수 있습니다. 이는 RBP가 없는 복잡한 mRNA 구조에 의한 리보좀 개시의 억제 가능성, 이는 낮은 기저 리포터 유전자 발현을 초래할 것이고, 따라서 RBP 결합에 대한 관찰력이 떨어지는 리포터 억압에 기인한다.
Introduction
RNA 결합 단백질(RBP)-기반 전사 후 조절, 특히 RBPs와 RNA 사이의 상호작용의 특성화는 최근 수십 년 동안 광범위하게 연구되고 있다. RBPs 억제에서 유래 하는 박테리아에서 번역 다운 조절의 여러 예가 있다, 또는직접 경쟁, 리보솜 바인딩 1,2,3. 합성 생물학 분야에서, RBP-RNA 상호 작용은 전사 기반 유전 회로4,5의설계를위한 중요한 도구로 부상하고 있다. 따라서, 세포 문맥에서 이러한 RBP-RNA 상호작용의 특성화에 대한 수요가 증가하고 있다.
단백질 RNA 상호 작용을 연구하기 위한 가장 일반적인 방법은 시험관내 설정으로 제한되는 전기동이동성 시프트 분석법(EMSA)6,및 CLIP 방법8,9를 포함한 다양한 풀다운 분석7이다. . 이러한 방법은 de novo RNA 결합 부위의 발견을 가능하게 하는 동안, 그들은 노동 집약적인 프로토콜 및 비싼 깊은 시퀀싱 반응과 같은 결점 때문에 손해를 입고 RBP 풀다운을 위한 특정 항체를 요구할 수 있습니다. 그것의 환경에 RNA의 영향을 받기 쉬운 특성 때문에, 많은 요인은 세포 문맥에서 RBP-RNA 결합을 심문하는 의 중요성을 강조하는 RBP-RNA 상호 작용에 영향을 미칠 수 있습니다. 예를 들어, 우리 및 그 외는 생체내 RNA 구조와 체외10,11사이의 유의한 차이를 입증하였다.
이전 연구12의접근법에 기초하여, 우리는 최근에 박테리오파지 GA13,MS214,PP715및 Qβ16에서 캡시드 RBP에 대한 미리 설계된 결합 부위를 배치할 때 10을 입증했다. [mRNA] 기자의 번역 개시 부위, 리포터 표현이 강하게 억압된다. 우리는 이 억압 현상에 근거하여, RBP와 그들의 대응하는 RNA 결합부위의 생체 내 친화성을 측정하기 위해 비교적 간단하고 정량적인 방법을 제시한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
본 항에 기술된 방법은 대장균 세포에서 RBP-RNA 결합 친화도의 생체 내 정량적 측정을 용이하게 한다. 이 프로토콜은 비교적 쉽고 정교한 기계를 사용하지 않고도 수행될 수 있으며 데이터 분석은 간단합니다. 더욱이, 결과는 차세대 염기서열 분석(NGS) 결과와 관련된 비교적 긴 대기 시간 없이 즉시 생성된다.
이 방법의 한 가지 제한은 세균 세포에서만 작동한다는 것입?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 프로젝트는 기획 및 예산 위원회의 I-CORE 프로그램과 이스라엘 과학 재단 (그랜트 번호 152/11), 마리 퀴리 재통합 보조금 번호에서 자금을 받았다. PCIG11-GA- 2012-321675, 및 보조금 계약 번호 664918에 따라 유럽 연합 (EU)의 호라이즌 2020 연구 및 혁신 프로그램에서 – MRG-문법.
Materials
| Ampicillin sodium salt | SIGMA | A9518 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | ALFA AESAR | 33337 | |
| 48 plates | Axygen | P-5ML-48-C-S | |
| 8- lane plates | Axygen | RESMW8I | |
| 96-well plates | Axygen | P-DW-20-C | |
| 96-well plates for plate reader | Perkin Elmer | 6005029 | |
| ApaLI | NEB | R0507 | |
| Binding site sequences | Gen9 Inc. and Twist Bioscience | see Table 1 | |
| E. coli TOP10 cells | Invitrogen | C404006 | |
| Eagl-HF | NEB | R3505 | |
| glycerol | BIO LAB | 071205 | |
| incubator | TECAN | liconic incubator | |
| Kanamycin solfate | SIGMA | K4000 | |
| KpnI- HF | NEB | R0142 | |
| ligase | NEB | B0202S | |
| liquid-handling robotic system | TECAN | EVO 100, MCA 96-channel | |
| Matlab analysis software | Mathworks | ||
| multi- pipette 8 lanes | Axygen | BR703710 | |
| N-butanoyl-L-homoserine lactone (C4-HSL) | cayman | K40982552 019 | |
| PBS buffer | Biological Industries | 020235A | |
| platereader | TECAN | Infinite F200 PRO | |
| Q5 HotStart Polymerase | NEB | M0493 | |
| RBP seqeunces | Addgene | 27121 & 40650 | see Table 2 |
| SODIUM CHLORIDE (NaCL) | BIO LAB | 190305 | |
| SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| Tryptone | BD | 211705 |
References
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