En mus modell av vascularized heterotopic Mjälttransplantation för att studera mjältens cell bio logi och transplantations immunitet

Summary

Detta protokoll specificerar de kirurgiska stegen i en mus modell av vaskulariserad heterotopisk mjälttransplantation, en tekniskt utmanande modell som kan fungera som ett kraftfullt verktyg för att studera öde och livs längd mjältceller, mekanismerna i distinkta mjälte cell populationer i sjukdomsprogression och transplantatimmunitet.

Abstract

Mjälten är en unik lymfoida organ som spelar en kritisk roll i homeostasen av immun försvaret och hematopoetiska system. Patienter som har genomgått splenektomi oavsett utfällnings orsaker är benägna att utveckla en överväldigande post-splenektomi infektion och uppleva ökade risker för djup ventrombos och maligniteter. Nyligen visade epidemiologiska studier att splenektomi kan associeras med förekomst av hjärt-kärlsjukdomar, vilket tyder på att de fysiologiska funktionerna hos mjälten ännu inte är fullt erkända. Här introducerar vi en mus modell av vaskulariserad heterotopisk mjälttransplantation, som inte bara kan utnyttjas för att studera funktionen och beteendemässiga aktiviteten av mjälten immun celler under grupper i olika biologiska processer, men också kan vara ett kraftfullt verktyg för att testa den terapeutiska potentialen hos mjälttransplantation vid vissa sjukdomar. De viktigaste kirurgiska stegen i denna modell inkluderar givare mjältskörd, avlägsnande av mottagaren infödda mjälte, och mjälttransplantat revascularization. Med hjälp av congenic mus stammar (t. ex. möss med CD 45,1/CD 45,2 bakgrunder), observerade vi att efter syngen transplantation, både donator-derived spleniska lymfocyter och myeloida celler som migrerats ut ur transplantatet så tidigt som postoperativ dag 1, samtidigt med inflödet av flera typer av mottagar celler, vilket skapar en unik Chimera.  Trots relativt utmanande tekniker, kan detta förfarande utföras med > 90% framgångs frekvens. Denna modell gör det möjligt att spåra öde, livs längd, och funktion av splenocyter under Steady State och i en sjukdoms inställning efter en mjälttransplantation, vilket erbjuder en stor möjlighet att upptäcka den distinkta roll för mjältderived immun celler i olika sjukdoms processer.

Introduction

Mjälten är den största sekundära lymfoida organ i kroppen och är kritisk i immun försvaret och hematopoetiska system. Dess funktioner utförs främst av två morfologiskt åtskilda fack, den röda massan och den vita massan¹. Den röda massan är en tredimensionell trabekelverket av venösa bihålor och mjältsladdar som består av retikulära fibrer, retikulära celler, och tillhör ande makro Fager. Denna unika struktur gör att den röda massan kan fungera som ett effektivt blod filter som avlägsnar främmande material och gamla eller skadade erytrocyter. Den vita massan innehåller folliklar, marginella zonen, och periarteriolar lymfoida slidor (PALS) och är en viktig plats för antigen fångst och bearbetning, lymfocyt homing, omvandling, proliferation, och mognad². Ändå har mjälten vanligt vis ansetts som ett dispenserbart organ eftersom andra lymfatiska organ, såsom lymf körtlar, kan också utföra vissa av dess funktioner och förlusten av mjälte inte brukar leda till döden. Splenektomi har därför i stor utsträckning utförts som en terapeutisk metod för patienter med mjältrör eller godartade Hematologiska sjukdomar³. Patienter med splenektomi står dock inför ett antal långvariga komplikationer. Bakteriella infektioner är de mest erkända komplikationer av splenektomi^4,5. Nyligen, den överväldigande post-splenektomi sepsis har erkänts som en intensiv komplikation av splenektomi i samband med en hög dödlighet⁶. Dessutom, nyligen epidemiologiska studier visar att splenektomi kan associeras med förekomsten av hjärt-kärlsjukdomar, vilket tyder på att ytterligare fysiologiska funktioner i mjälten återstår att utforskas^7,8.

Både mjältens autotransplantation och mjältallotransplantation har använts på kliniken. För närvarande anses mjältens autotransplantation genom att implantera delar av mjältvävnad i påsar som skapas i större omentum som den enda möjligheten för att bevara mjältfunktion efter traumatisk splenektomi^9,10. Emellertid, effekten av denna operation är diskutabel som post-kirurgi komplikationer som aseptisk nekros av mjälten vävnad och små tarm obstruktion på grund av postoperativa sammanväxningar kan inträffa¹¹. Mjältallotransplantation är involverad i multiorgan transplantation¹². Kliniska belägg från multiorgan transplantation tyder på att mjältallotransplantation kan spela en skyddande roll i avstötning av små tarm transplantat utan att orsaka transplantat-mot-värdsjukdom (GVHD)¹². Men litteraturen om den gynnsamma effekten av mjältallotransplantation som en komponent i multiorgan transplantation är fortfarande begränsad och de bakomliggande mekanismerna återstår att definiera. I 2006, Yair Reisner et al. rapporterade att transplantation av svin embryonal mjältvävnad som inte har några T-celler till möss kan bota hemofili A, en genetisk sjukdom utan att orsaka GVHD¹³, stödja att mjälten transplantation innehar terapeutiska löfte i vissa sjukdomar. Därför finns det ett behov av ytterligare undersökningar om den terapeutiska potentialen av mjälttransplantation.

Djur modeller av mjälttransplantation är värdefulla för att utforska den ouppskattade funktionen hos de mjälthärledda immun cellerna i sjukdomsprogression samt för att testa den potentiella terapeutiska effekten av mjälttransplantation. Experimentella hela mjälten transplantations modeller har dokumenterats sedan början av 1900-talet, som granskats av Cohen¹⁴. I 1969, Coburn Richard J. och Lee et al. detaljerade tekniken för mjälttransplantation hos råttor^15,16. Mer nyligen beskrev Swirski FK et al. en mus modell av mjälttransplantation¹⁷. Jämfört med råtta modeller, mus modeller av mjälttransplantation är mer attraktiva på grund av dess flera inneboende fördelar. Till exempel, genom att använda en mus modell, kan vi få till gång till en expansiv mängd reagenser otillgängliga för råtta modeller. Genom att använda congenic möss (t. ex. möss med CD 45,1/CD 45,2 bakgrund), en syngen mjälttransplantation gör det möjligt att spåra ödet, livs längd, och funktion av splenocyter¹⁸. Baserat på arbetet med Swirski FK et al.¹⁷, har vi vidare etablerat detta förenklade och förbättrade protokoll av mjälttransplantation hos möss. Protokollet som beskrivs nedan kombinerar både tillförlitlighet och genomförbarhet på ett standardiserat sätt och kan användas som ett verktyg för att studera mjältbiologi och transplantatimmunitet.

Protocol

Alla procedurer och djur användning i denna studie utfördes enligt protokoll som godkänts av den nordvästra universitets interna djur Vårds-och användnings kommitté (IACUC). I denna studie, 8 till 10 vecka gamla manliga CD 45,2 och CD 45,1 möss (både på BALB/c bakgrund, från Jackson laboratorium) användes som mjältgivare och mottagare, respektive, för att skapa syngena mjälte transplantation modeller. Alla djur var inhysta i den sterila miljön i djur anläggningarna vid Northwestern University. Ögon Smö…

Representative Results

Hela förfarandet för mus mjälte transplantation kan slutföras inom 90 min av erfarna mikrokirurger. Vårt laboratorium har utfört över 100 mjälttransplantationer hos möss. Framgången är över 90%, som definieras av överlevnaden av både mottagare mus och mjälte transplantat till postoperativ dag (POD) 1 eller POD 7 (vår studie Endpoint). Överlevnaden av mjälttransplantatet bekräftades genom makroskopiska utseende och flödescytometri analys av splenocyter. Baserat på vår…

Discussion

Övertygande bevis tyder på att mjältderived monocyter spelar en viktig roll i sterila inflammatoriska processer såsom åder förkalkning¹⁹, akut ischemisk hjärna²⁰ eller lung skada¹⁸, samt hjärt infarkt i/R skada och remodeling^21,22,23. Dessa rapporter belyser den under erkännande roll mjälten i många kroniska sjukdomar, varav hjärt-kärlsjukdom ä…

Materials

Ketamine	Wyeth	206205-01
Xylazine	Lloyd Laboratories	139-236
Heparin solution	Abraxis Pharmaceutical Products	504031
Injection grade normal saline	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-20
70% Ethanol	Pharmco Products Inc.	111000140
ThermoCare Small Animal ICU System	Thermocare, Inc.
Adson Forceps	Roboz Surgical Instruments	RS-5230
Derf Needle Holder	Roboz Surgical Instruments	RS-7822
Extra Fine Micro Dissecting Scissors	Roboz Surgical Instruments	RS-5881
Micro-clip	Roboz Surgical Instruments	RS-5420
7-0 silk	Braintree Scientific	SUT-S 103
11-0 nylon on 4-mm (3/8) needle	Sharpoint DR4	AK-2119
Ms CD45.2 antibody	BD Bioscience	553772
Ms CD45.1 antibody	BD Bioscience	553776
Ms CD11b antibody	BD Bioscience	557657
Ms B220 antibody	BD Bioscience	553089
Ms Ly6C antibody	eBioscience	48-5932-80
Ms Ly6G antibody	BD Bioscience	561236
Ms F4/80 antibody	BD Bioscience	565614
Ms CD11c antibody	BD Bioscience	558079
Ms CD3 antibody	eBioscience	48-0032-82
Ms CD4 antibody	BD Bioscience	552051
Ms CD8 antibody	BD Bioscience	563786
LIVE/DEAD™ Fixable Violet Dead Cell Stain Kit	Thermo Fisher	L34955