Studiare le dinamiche di Organelle nelle cellule B durante la formazione immunitaria di sinapsi
Summary
Qui descriviamo due approcci per caratterizzare gli eventi di polarizzazione cellulare nei linfociti B durante la formazione di un IS. Il primo, comporta la quantificazione del reclutamento di organelli e riarrangiamenti del citoscheletro nella membrana sinaptica. Il secondo è un approccio biochimico, per caratterizzare i cambiamenti nella composizione del centrosome, che subisce la polarizzazione alla sinapsi immunitaria.
Abstract
Il riconoscimento degli antigeni legati alla superficie da parte del recettore delle cellule B (BCR) innesca la formazione di una sinapsi immunitaria (IS), in cui sono coordinati sia la segnalazione che l’assorbimento dell’antigene. La formazione dell’IS comporta un rimodellamento dinamico dell’actina accompagnato dal reclutamento polarizzato nella membrana sinaptica degli organelli centrocellulari e intracellulari associati come i lisosomi e l’apparato di Golgi. Le fasi iniziali del rimodellamento dell’actin consentono alle cellule B di aumentare la superficie cellulare e massimizzare la quantità di complessi antigene-BCR raccolti alla sinapsi. In determinate condizioni, quando le cellule B riconoscono gli antigeni associati alle superfici rigide, questo processo è accoppiato al reclutamento locale e alla secrezione di lisosomi, che possono facilitare l’estrazione dell’antigene. Gli antigeni assorbiti vengono internalizzati in compartimenti endolsomici specializzati per la lavorazione in peptidi, che vengono caricati su molecole principali del complesso di istocompatibilità II (MHC-II) per un’ulteriore presentazione alle cellule che aiutano T. Pertanto, studiare le dinamiche di orgelli associate alla formazione di un IS è fondamentale per comprendere come vengono attivate le cellule B. Nel presente articolo discuteremo sia l’imaging che una tecnica biochimica utilizzata per studiare i cambiamenti nel posizionamento degli organelli intracellulari e nei riarrangiamenti del citoscheletro associati alla formazione di una IS nelle cellule B.
Introduction
I linfociti B sono una parte essenziale del sistema immunitario adattivo responsabile della produzione di anticorpi contro diverse minacce e dell’invasione degli agenti patogeni. L’efficienza della produzione di anticorpi è determinata dalla capacità delle cellule B di acquisire, elaborare e presentare antigeni incontrati in forma solubile o con tebranda superficiale1,2. Il riconoscimento degli antigeni attaccati alla superficie di una cellula di presentazione, da parte del BCR, porta alla formazione di uno stretto contatto intercellulare chiamato IS3,4. All’interno di questa piattaforma dinamica avviene sia la segnalazione a valle dipendente da BCR che l’internalizzazione degli antigeni in compartimenti endososomi. Gli antigeni assorbiti vengono elaborati e assemblati su molecole MHC-II e successivamente presentati ai linfociti T. Le interazioni B-T produttive, definite cooperazione cellulare B-T, permettono ai linfociti B di ricevere i segnali appropriati, che promuovono la loro differenziazione in plasmacellule o celle di memoria che producono anticorpi o cellule di memoria8.
Due meccanismi sono stati coinvolti nell’estrazione dell’antigene da parte delle cellule B. Il primo si basa sulla secrezione di proteasi provenienti da lisosomi che subiscono il reclutamento e la fusione presso la fessura sinaptica5,6. Il secondo, dipende da forze di trazione mediate Myosin IIA che innesca l’invaginazione dell’antigene contenente membrane che sono internalizzate in pozzi rivestiti di clathrin7 . La modalità di estrazione dell’antigene si basa sulle proprietà fisiche della membrana in cui si trovano gli antigeni. Tuttavia, in entrambi i casi, le cellule B subiscono due grandi eventi di rimodellamento: la riorganizzazione del citoscheletro actin e la polarizzazione degli organelli all’IS. Il rimodellamento del citoscheletro actina comporta una fase iniziale di diffusione, in cui le protrusioni dipendenti dall’actina nella membrana sinaptica aumentano la superficie a contatto con l’antigene. Segue una fase di contrazione, in cui le BCR accoppiate con gli antigeni sono concentrate al centro dell’IS dall’azione concertata dei motori molecolari e del rimodellamento del citoscheletro actina8,9,10, 11. La polarizzazione degli organelli si basa anche sulla ristrutturazione del citoscheletro actin. Ad esempio, il centrosore diventa disaccoppiato dal nucleo, dalla depolimerizzazione locale dell’actina associata,che consente il riposizionamento di questo organello all’IS 5,12. Nelle cellule B, il riposizionamento del centrosore a un polo cellulare (IS) guida il reclutamento di lisomi nella membrana sinaptica, che alla secrezione può facilitare l’estrazione e/o l’elaborazione di antigeni ad essere tesi dalla superficie6. I lisosomici reclutati all’IS sono arricchiti da MHC-II, che favorisce la formazione di complessi peptidi-MHC-II in compartimenti endosomici da presentare alle cellule T13. Inoltre, l’apparato di Golgi è stato osservato anche per essere reclutato da vicino all’IS14, suggerendo che le vesciche derivate da Golgi dal percorso secretoria potrebbero essere coinvolte nell’estrazione e/o nella lavorazione degli antigeni.
Complessivamente, i riarrangiamenti intracellulari di organelli e citoscheletri nelle cellule B durante la formazione di sinapsi sono i passi chiave che consentono un’efficiente acquisizione e elaborazione di antigeni necessari per la loro ulteriore attivazione. In questo lavoro introduciamo protocolli dettagliati su come eseguire l’imaging e l’analisi biochimica nelle cellule B per studiare il rimodellamento intracellulare degli organelli associati alla formazione di un IS. Queste tecniche includono: (i) Immunofluorescenza e analisi delle immagini delle cellule B attivate con perline rivestite di antigeni e su coverlips rivestiti di antigeni, che consente la visualizzazione e la quantificazione di componenti intracellulari mobilitati all’IS e (ii ) isolamento delle frazioni arricchite di centrosomi nelle cellule B mediante ultracentrifugazione su gradienti di saccarosio, che consente l’identificazione delle proteine associate al centroso, potenzialmente coinvolto nella regolazione della polarità cellulare.
Protocol
Representative Results
Discussion
Descriviamo un metodo completo per studiare come i linfociti B riorganizzano la loro architettura intracellulare per promuovere la formazione di un IS. Questo studio include l’uso di tecniche di imaging per quantificare la distribuzione intracellulare di organelli, come centrosome, apparato di Golgi e lisosomi durante l’attivazione della cellula B, e come si polarizzano all’IS. Inoltre, descriviamo un approccio biochimico allo studio dei cambiamenti nella composizione centrosoria dopo l’attivazione delle cellule B.
<…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.-I.Y. è supportato da una borsa di ricerca di FONDECYT #1180900. J.I., D.F. e J.L. sono stati sostenuti da borse di studio del Comisiàn Nacional de Ciencia y Tecnolog. Ringraziamo David Osorio della Pontificia Universidad Catalia de Chile per la registrazione video e l’editing.
Materials
| IIA1.6 (A20 variant) mouse B-lymphoma cells | ATCC | TIB-208 | Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface without FcγIIR |
| 100% methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| 10-mm diameter cover glasses thickness No. 1 circular | Marienfield-Superior | 111500 | |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| Alexa 488 fluor- donkey ant-rabbit IgG | LifeTech | A21206 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Alexa Fluor 546 goat anti-Rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11071 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Alexa Fluor 647-conjugated phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A21238 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Amaxa Nucleofection kit V | Lonza | VCA-1003 | Follow the manufacturer's directions for mixing the transfection reagents with the DNA |
| Amaxa Nucleofector model 2b | Lonza | AAB-1001 | Program L-013 used |
| Amino- Dynabeads | ThermoFisher | 14307D | |
| Anti-pericentrin | Abcam | ab4448 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Anti-rab6 | Abcam | ab95954 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Anti-sec61 | Abcam | ab15575 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| BSA | Winkler | BM-0150 | |
| CaCl2 | Winkler | CA-0520 | |
| Culture plate T25 | BD | 353014 | |
| Fiji Software | Fiji col. | ||
| Fluoromount G | Electron Microscopy Science | 17984-25 | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G7651 | |
| Glycine | Winkler | BM-0820 | |
| Goat-anti-mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 315-005-003 | IIA1.6 positive ligand |
| Goat-anti-mouse IgM antibody | Thermo Fisher Scientific | 31186 | IIA1.6 negative ligand |
| HyClone Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | SH30071.03 | Heat inactivate at 56 oC for 30 min |
| KCl | Winkler | PO-1260 | |
| Leica SP8 TCS microscope | Leica | ||
| NaCl | Winkler | SO-1455 | |
| Nikon Eclipse Ti-E epifluorescence microscope | Nikon | ||
| Parafilm | M | P1150-2 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 30525-89-4 | Dilute to 4% with PBS in a safety cabinet, use at the moment |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Liquid |
| Polybead Amino Microspheres 3.00μm | Polyscience | 17145-5 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | Dilute with sterile water |
| Rabbit anti- alpha tubulin antibody | Abcam | ab6160 | 1:1000 dilution recommended but should be optimized |
| Rabbit anti mouse lamp1 antibody | Cell signaling | 3243 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Rabbit anti-cep55 | Abcam | ab170414 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Rabbit Anti-gamma Tubulin antibody | Abcam | ab16504 | 1:1000 for Western Blot |
| RPMI-1640 | Biological Industries | 01-104-1A | |
| Saponin | Merck | 558255 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| Sucrose | Winkler | SA-1390 | |
| Triton X-100 | Merck | 9036-19-5 | |
| Tube 50 ml | Corning | 353043 |
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