Изучение динамики органелл в В-клетках во время формирования иммунного синапса
Summary
Здесь мы описываем два подхода к характеристике событий поляризации клеток в лимфоцитах B во время формирования ИГ. Во-первых, включает в себя количественную оценку набора органелл и цитоскелет перестановки на синаптической мембраны. Второй – биохимический подход, характеризующий изменения в составе центросомы, которая подвергается поляризации иммунной синапса.
Abstract
Распознавание поверхностных антигенов рецептором В-клеток (BCR) вызывает образование иммунного синапса (ИС), где координируются как сигнальные, так и антигенные поглощения. Формирование ИГ включает в себя динамическую ремоделирование актина, сопровождаемую поляризованной вербовкой в синаптическую мембрану центросомы и связанных с ними внутриклеточных органелл, таких как лизосомы и аппарат Голги. Первоначальные этапы ремоделирования актина позволяют В-клеткам увеличивать свою поверхность клеток и максимизировать количество комплексов антиген-БКР, собранных в синапсе. При определенных условиях, когда В-клетки распознают антигены, связанные с жесткими поверхностями, этот процесс связан с местным набором и секрецией лизосомы, которые могут облегчить экстракции антигена. Поглощенные антигены интернализированы в специализированные эндо-лизосомы отсеки для обработки в пептиды, которые загружаются на основные молекулы гистосовместимости II (MHC-II) для дальнейшего представления T-клеткам-помощникам. Поэтому изучение динамики органелл, связанной с формированием ИС, имеет решающее значение для понимания того, как активируются вхлговые клетки. В настоящей статье мы обсудим как визуализацию, так и биохимический метод, используемый для изучения изменений внутриклеточного позиционирования органелл и изменения цитоскелетов, связанные с образованием ИС в В-клетках.
Introduction
B лимфоциты являются неотъемлемой частью адаптивной иммунной системы, ответственной за выработку антител против различных угроз и вторжения патогенов. Эффективность производства антител определяется способностью В-клеток приобретать, обрабатывать и представлять антигены, встречающиесялибо в растворимой или поверхностной форме 1,2. Распознавание антигенов, прикрепленных к поверхности клетки представления, БКР, приводит к образованию близкого межклеточного контакта под видом IS3,4. В рамках этой динамической платформы происходит как BCR-зависимых вниз по течению сигнализации и интернализации антигенов в эндо-лизосомы отсеков происходит. Убранные антигены обрабатываются и собираются на молекулы MHC-II и впоследствии подаются Т-лимфоцитам. Продуктивные B-T взаимодействия, называемые B-T-клеток сотрудничества, позволяют B лимфоцитов для получения соответствующих сигналов, которые способствуют их дифференциации в антитела производства плазматических клеток или клеток памяти8.
Два механизма были вовлечены в экстракцию антигена в клетках В. Первый опирается на секрецию протеаз, происходящих из лизосом, которые подвергаются набору и слиянию при синаптической расщелине5,6. Второй, зависит от Миозина IIA-опосредованных сил, что вызывает вагинацию антигена, содержащего мембраны, которые интернализированы в clathrin покрытием ямы7. Режим экстракции антигена зависит от физических свойств мембраны, в которой находятся антигены. Тем не менее, в обоих случаях, В клетки проходят два основных события реконструкции: актиновый цитоскелет реорганизации и поляризации органелл в IS. Actin цитоскелет ремоделирования включает в себя начальную стадию распространения, где актин-зависимых выступов в синаптической мембраны увеличить поверхность в контакте с антигеном. За этим следует фаза сокращения, где BCRs в сочетании с антигенами сосредоточены в центре ИС с согласованным действием молекулярных двигателей и актина цитоскелет ремоделирования8,9,10, 11. Поляризация органелл также опирается на ремоделирование актина цитоскелета. Например, центросома становится отсоединена от ядра, путем локальной деполимеризации ассоциированного актина, что позволяет перепозиционировать эту органель вIS 5,12. В В-клетки, перепозиционирование центросомы на один полюс клетки (IS) направляет лизосомы вербовки в синаптической мембраны, которая при секреции может облегчить добычу и / или обработки поверхностных антигенов6. Лисососомы, завербованные в ИГ, обогащаются MHC-II, что способствует образованию пептидных комплексов MHC-II в эндосомальных отсеках, которые будут представлены Т-клеткам13. Кроме того, было отмечено, что аппарат Голги был тесно завербован вIS 14,предполагая, что пузырьки, полученные голги из секреторного пути, могут быть вовлечены в добычу антигена и/или обработку.
В целом, внутриклеточные органеллы и цитоскелетные перестановки в В-клетках во время формирования синапсов являются ключевыми шагами, которые позволяют эффективное приобретение и обработку антигена, необходимые для их дальнейшей активации. В этой работе мы вводим подробные протоколы о том, как выполнять визуализацию и биохимический анализ в В-клетках для изучения внутриклеточной ремоделирования органелл, связанных с образованием ИС. Эти методы включают: i) иммунофлуоресценцию и анализ изображений В-клеток, активированных с антигеном покрытием бусины и на антиген-покрытие крышки, что позволяет визуализации и количественной внутриклеточной компоненты, которые мобилизованы в ИС и (ii ) изоляция обогащенных центросомой фракций в В-клетках путем ультрацентрифугирования на градиентах сахарозы, что позволяет выявлять белки, связанные с центросомой, потенциально участвующих в регулировании полярности клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы описываем комплексный метод изучения того, как Лимфоциты B реорганизуют свою внутриклеточную архитектуру для содействия формированию ИГ. Это исследование включает в себя использование методов визуализации для количественной оценки внутриклеточного распределения органелл, таких …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.-I.Y. поддерживается исследовательским грантом от FONDECYT #1180900. J.I., D.F. и J.L. были поддержаны стипендиями от Национального комисиона de Ciencia y Tecnologa. Мы благодарим Дэвида Осорио из Университета Понтифики Каталонии за видеозапись и редактирование.
Materials
| IIA1.6 (A20 variant) mouse B-lymphoma cells | ATCC | TIB-208 | Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface without FcγIIR |
| 100% methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| 10-mm diameter cover glasses thickness No. 1 circular | Marienfield-Superior | 111500 | |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| Alexa 488 fluor- donkey ant-rabbit IgG | LifeTech | A21206 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Alexa Fluor 546 goat anti-Rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11071 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Alexa Fluor 647-conjugated phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A21238 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Amaxa Nucleofection kit V | Lonza | VCA-1003 | Follow the manufacturer's directions for mixing the transfection reagents with the DNA |
| Amaxa Nucleofector model 2b | Lonza | AAB-1001 | Program L-013 used |
| Amino- Dynabeads | ThermoFisher | 14307D | |
| Anti-pericentrin | Abcam | ab4448 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Anti-rab6 | Abcam | ab95954 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Anti-sec61 | Abcam | ab15575 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| BSA | Winkler | BM-0150 | |
| CaCl2 | Winkler | CA-0520 | |
| Culture plate T25 | BD | 353014 | |
| Fiji Software | Fiji col. | ||
| Fluoromount G | Electron Microscopy Science | 17984-25 | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G7651 | |
| Glycine | Winkler | BM-0820 | |
| Goat-anti-mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 315-005-003 | IIA1.6 positive ligand |
| Goat-anti-mouse IgM antibody | Thermo Fisher Scientific | 31186 | IIA1.6 negative ligand |
| HyClone Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | SH30071.03 | Heat inactivate at 56 oC for 30 min |
| KCl | Winkler | PO-1260 | |
| Leica SP8 TCS microscope | Leica | ||
| NaCl | Winkler | SO-1455 | |
| Nikon Eclipse Ti-E epifluorescence microscope | Nikon | ||
| Parafilm | M | P1150-2 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 30525-89-4 | Dilute to 4% with PBS in a safety cabinet, use at the moment |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Liquid |
| Polybead Amino Microspheres 3.00μm | Polyscience | 17145-5 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | Dilute with sterile water |
| Rabbit anti- alpha tubulin antibody | Abcam | ab6160 | 1:1000 dilution recommended but should be optimized |
| Rabbit anti mouse lamp1 antibody | Cell signaling | 3243 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Rabbit anti-cep55 | Abcam | ab170414 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Rabbit Anti-gamma Tubulin antibody | Abcam | ab16504 | 1:1000 for Western Blot |
| RPMI-1640 | Biological Industries | 01-104-1A | |
| Saponin | Merck | 558255 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| Sucrose | Winkler | SA-1390 | |
| Triton X-100 | Merck | 9036-19-5 | |
| Tube 50 ml | Corning | 353043 |
References
- Carrasco, Y. R., Batista, F. D. B. Cells Acquire Particulate Antigen in a Macrophage-Rich Area at the Boundary between the Follicle and the Subcapsular Sinus of the Lymph Node. Immunity. 27 (1), 160-171 (2007).
- Batista, F. D., Harwood, N. E. The who, how and where of antigen presentation to B cells. Nature Reviews Immunology. 9 (1), 15-27 (2009).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science (New York, N.Y.). 285 (5425), 221-227 (1999).
- Batista, F. D., Iber, D., Neuberger, M. S. B cells acquire antigen from target cells after synapse formation. Nature. 411 (6836), 489-494 (2001).
- Obino, D., et al. Actin nucleation at the centrosome controls lymphocyte polarity. Nature Communications. 7, (2016).
- Yuseff, M. I., et al. Polarized Secretion of Lysosomes at the B Cell Synapse Couples Antigen Extraction to Processing and Presentation. Immunity. 35 (3), 361-374 (2011).
- Spillane, K. M., Tolar, P. Mechanics of antigen extraction in the B cell synapse. Molecular Immunology. 101, 319-328 (2018).
- Schnyder, T., et al. B Cell Receptor-Mediated Antigen Gathering Requires Ubiquitin Ligase Cbl and Adaptors Grb2 and Dok-3 to Recruit Dynein to the Signaling Microcluster. Immunity. , (2011).
- Wang, J. C., et al. The Rap1 – cofilin-1 pathway coordinates actin reorganization and MTOC polarization at the B cell immune synapse. Journal of Cell Science. , 1094-1109 (2017).
- Fleire, S. J., Goldman, J. P., Carrasco, Y. R., Weber, M., Bray, D., Batista, F. D. B cell ligand discrimination through a spreading and contraction response. Science. 312 (5774), 738-741 (2006).
- Vascotto, F., et al. The actin-based motor protein myosin II regulates MHC class II trafficking and BCR-driven antigen presentation. Journal of Cell Biology. 176 (7), 1007-1019 (2007).
- Reversat, A., et al. Polarity protein Par3 controls B-cell receptor dynamics and antigen extraction at the immune synapse. Molecular biology of the cell. 26 (7), 1273-1285 (2015).
- Lankar, D., et al. Dynamics of Major Histocompatibility Complex Class II Compartments during B Cell Receptor–mediated Cell Activation. The Journal of Experimental Medicine. 195 (4), 461-472 (2002).
- Duchez, S., et al. Reciprocal Polarization of T and B Cells at the Immunological Synapse. The Journal of Immunology. 187 (9), 4571-4580 (2011).
- Pérez-Montesinos, G., et al. Dynamic changes in the intracellular association of selected rab small GTPases with MHC class II and DM during dendritic cell maturation. Frontiers in Immunology. 8 (MAR), 1-15 (2017).
- Le Roux, D., Lankar, D., Yuseff, M. I., Vascotto, F., Yokozeki, T., Faure-Andre´, G., Mougneau, E., Glaichenhaus, N., Manoury, B., Bonnerot, C., Lennon-Dume´nil, A. M. Syk-dependent Actin Dynamics Regulate Endocytic Trafficking and Processing of Antigens Internalized through the B-Cell Receptor. Molecular biology of the cell. 18 (September), 3451-3462 (2007).
- Reber, S. Chapter 8 Isolation of Centrosomes from Cultured Cells. Methods in Molecular Biology. 777 (2), 107-116 (2011).
- Gogendeau, D., Guichard, P., Tassin, A. M. Purification of centrosomes from mammalian cell lines. Methods in Cell Biology. 129, (2015).
- Obino, D., et al. Vamp-7–dependent secretion at the immune synapse regulates antigen extraction and presentation in B-lymphocytes. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 890-897 (2017).
- Harwood, N. E., Batista, F. D. Early Events in B Cell Activation BCR: B cell receptor. Annual Review of Immunology. , (2010).
- Yuseff, M. I., Lennon-Duménil, A. M. B cells use conserved polarity cues to regulate their antigen processing and presentation functions. Frontiers in Immunology. 6, 1-7 (2015).
