Studera Organelledynamik i B-celler under Immunsynapsebildningen
Summary
Häri beskriver vi två metoder för att karakterisera cellpolariseringshändelser i B-lymfocyter under bildandet av en IS. Den första, innebär kvantifiering av organell rekrytering och cytoskelettet rearrangemang vid Synaptic membranet. Den andra är en biokemisk metod, att karakterisera förändringar i sammansättningen av centrosome, som genomgår polarisering till immun synapsen.
Abstract
Erkännande av ytbundna antigener av B-cellreceptorn (BCR) utlöser bildandet av en immunsynapse (IS), där både signalering och antigen upptag samordnas. Är bildandet innebär dynamisk aktin remodeling åtföljs av den polariserade rekrytering till Synaptic membranet i centrosom och tillhörande intracellulära organeller såsom lysosomer och Golgi apparaten. Inledande stadier av aktin remodeling tillåta B-celler att öka sin cellyta och maximera mängden antigen-BCR komplex samlades vid synapsen. Under vissa förhållanden, när B-celler känner igen antigener i samband med stela ytor, är denna process kopplad till den lokala rekryteringen och utsöndringen av lysosomer, vilket kan underlätta antigen utvinning. Uptaken antigener internaliseras till specialiserade endo-lysosome fack för bearbetning till peptider, som lastas på större histocompatibility complex II (MHC-II) molekyler för vidare presentation till T Helper celler. Därför är att studera organell dynamik i samband med bildandet av en är avgörande för att förstå hur B-celler aktiveras. I den nuvarande artikeln kommer vi att diskutera både avbildning och en biokemisk teknik som används för att studera förändringar i intracellulär organell positionering och cytoskelettet rearrangemang som är förknippade med bildandet av en är i B-celler.
Introduction
B-lymfocyter är en viktig del av det adaptiva immunsystemet som ansvarar för att producera antikroppar mot olika hot och invaderande patogener. Effektiviteten i produktionen av antikroppar bestäms av B-cellernas förmåga att förvärva, bearbeta och presentera antigener som påträffas antingen i en löslig eller ytuppbundna form1,2. Erkännande av antigener som är knutna till ytan av en presenterande cell, av BCR, leder till bildandet av en nära intercellulära kontakt kallas är3,4. Inom denna dynamiska plattform sker både BCR-beroende nedströms signalering och internalisering av antigener till endo-lysosome fack. Uptaken antigener bearbetas och monteras på MHC-II molekyler och därefter presenteras för T-lymfocyter. Produktiva B-T interaktioner, benämnd B-T cell samarbete, tillåta B-lymfocyter att ta emot lämpliga signaler, som främjar deras differentiering till antikroppsproducerande plasmaceller eller minnesceller8.
Två mekanismer har varit inblandade i antigen utvinning av B-celler. Den första är beroende av utsöndringen av proteaser från lysosomer som genomgår rekrytering och fusion vid den synaptiska spalten5,6. Den andra, beror på myosin IIA-medierade dragkrafter som utlöser invagination av antigen som innehåller membran som internaliseras i clathrin-belagda gropar7. Läget för antigen utvinning förlitar sig på de fysikaliska egenskaperna hos det membran där antigener påträffas. Ändå, i båda fallen, B-celler genomgår två stora remodeling händelser: aktin cytoskelettet omorganisering och polarisering av organeller till is. Actin cytoskelettet remodeling innebär en första spridning skede, där Actin-beroende utskjutande på Synaptic membranet öka ytan i kontakt med antigenet. Detta följs av en kontraktion arrangerar gradvis, var bcrs tillsammans med antigener koncentreras i centrera av är vid den samordnade handlingen av molekylära motorer och aktin cytoskelettet remodeling8,9,10, 11. polarisering av organeller förlitar sig också på ombyggnad av aktin cytoskeleton. Till exempel blir centrosom unhopkopplad från kärnan, av lokala depolymerization av tillhörande aktin, som gör det möjligt att repositionera av denna organell till är5,12. I B-celler, ompositionering av centrosom till en cell Pole (is) guider Lysosomen rekrytering till Synaptic membranet, som vid sekretion kan underlätta utvinning och/eller bearbetning av ytbundna antigener6. Lysosomer rekryteras på IS är berikade med MHC-II, som gynnar bildandet av peptid-MHC-II komplex i endosomalt fack som skall presenteras för T-celler13. Dessutom har den Golgi apparaten också observerats för att vara nära rekryteras till IS14, vilket tyder på att Golgi-härledda blåsor från den sekretoriska vägen kan vara inblandade i antigen utvinning och/eller bearbetning.
Helt och hållet, intracellulära organell och cytoskelettet rearrangemang i B-celler under synapsen bildas är de viktigaste stegen som möjliggör effektiv antigen förvärv och bearbetning krävs för deras vidare aktivering. I detta arbete introducerar vi detaljerade protokoll om hur man utför avbildning och biokemisk analys i B-celler för att studera den intracellulära remodeling av organeller i samband med bildandet av en IS. Dessa tekniker inkluderar: (i) immunofluorescens och bildanalys av B-celler som aktiveras med antigen-belagda pärlor och på antigen-belagda täckglas, vilket möjliggör visualisering och kvantifiering av intracellulära komponenter som mobiliseras till IS och (II ) isolering av centrosome-berikade fraktioner i B-celler genom ultracentrifugering på sackaros gradienter, som gör det möjligt att identifiera proteiner i samband med centrosome, potentiellt involverade i regleringen av cellernas polaritet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi beskriver en omfattande metod för att studera hur B-lymfocyter omorganisera sin intracellulära arkitektur för att främja bildandet av en IS. Denna studie omfattar användning av avbildningstekniker för att kvantifiera den intracellulära fördelningen av organeller, såsom centrosome, Golgi apparat och lysosomer under B cell aktiveringen, och hur de polariserar till IS. Dessutom beskriver vi en biokemisk metod för att studera förändringar i centrosom komposition vid B-cellsaktivering.
<p class="jove_conten…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.-I.Y. stöds av ett forskningsanslag från FONDECYT #1180900. J.I., D.F. och J.L. stöddes av stipendier från Comisión Nacional de Ciencia y Tecnología. Vi tackar David Osorio från Pontificia Universidad Católica de Chile för videoinspelning och redigering.
Materials
| IIA1.6 (A20 variant) mouse B-lymphoma cells | ATCC | TIB-208 | Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface without FcγIIR |
| 100% methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| 10-mm diameter cover glasses thickness No. 1 circular | Marienfield-Superior | 111500 | |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| Alexa 488 fluor- donkey ant-rabbit IgG | LifeTech | A21206 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Alexa Fluor 546 goat anti-Rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11071 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Alexa Fluor 647-conjugated phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A21238 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Amaxa Nucleofection kit V | Lonza | VCA-1003 | Follow the manufacturer's directions for mixing the transfection reagents with the DNA |
| Amaxa Nucleofector model 2b | Lonza | AAB-1001 | Program L-013 used |
| Amino- Dynabeads | ThermoFisher | 14307D | |
| Anti-pericentrin | Abcam | ab4448 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Anti-rab6 | Abcam | ab95954 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Anti-sec61 | Abcam | ab15575 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| BSA | Winkler | BM-0150 | |
| CaCl2 | Winkler | CA-0520 | |
| Culture plate T25 | BD | 353014 | |
| Fiji Software | Fiji col. | ||
| Fluoromount G | Electron Microscopy Science | 17984-25 | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G7651 | |
| Glycine | Winkler | BM-0820 | |
| Goat-anti-mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 315-005-003 | IIA1.6 positive ligand |
| Goat-anti-mouse IgM antibody | Thermo Fisher Scientific | 31186 | IIA1.6 negative ligand |
| HyClone Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | SH30071.03 | Heat inactivate at 56 oC for 30 min |
| KCl | Winkler | PO-1260 | |
| Leica SP8 TCS microscope | Leica | ||
| NaCl | Winkler | SO-1455 | |
| Nikon Eclipse Ti-E epifluorescence microscope | Nikon | ||
| Parafilm | M | P1150-2 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 30525-89-4 | Dilute to 4% with PBS in a safety cabinet, use at the moment |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Liquid |
| Polybead Amino Microspheres 3.00μm | Polyscience | 17145-5 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | Dilute with sterile water |
| Rabbit anti- alpha tubulin antibody | Abcam | ab6160 | 1:1000 dilution recommended but should be optimized |
| Rabbit anti mouse lamp1 antibody | Cell signaling | 3243 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Rabbit anti-cep55 | Abcam | ab170414 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Rabbit Anti-gamma Tubulin antibody | Abcam | ab16504 | 1:1000 for Western Blot |
| RPMI-1640 | Biological Industries | 01-104-1A | |
| Saponin | Merck | 558255 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| Sucrose | Winkler | SA-1390 | |
| Triton X-100 | Merck | 9036-19-5 | |
| Tube 50 ml | Corning | 353043 |
References
- Carrasco, Y. R., Batista, F. D. B. Cells Acquire Particulate Antigen in a Macrophage-Rich Area at the Boundary between the Follicle and the Subcapsular Sinus of the Lymph Node. Immunity. 27 (1), 160-171 (2007).
- Batista, F. D., Harwood, N. E. The who, how and where of antigen presentation to B cells. Nature Reviews Immunology. 9 (1), 15-27 (2009).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science (New York, N.Y.). 285 (5425), 221-227 (1999).
- Batista, F. D., Iber, D., Neuberger, M. S. B cells acquire antigen from target cells after synapse formation. Nature. 411 (6836), 489-494 (2001).
- Obino, D., et al. Actin nucleation at the centrosome controls lymphocyte polarity. Nature Communications. 7, (2016).
- Yuseff, M. I., et al. Polarized Secretion of Lysosomes at the B Cell Synapse Couples Antigen Extraction to Processing and Presentation. Immunity. 35 (3), 361-374 (2011).
- Spillane, K. M., Tolar, P. Mechanics of antigen extraction in the B cell synapse. Molecular Immunology. 101, 319-328 (2018).
- Schnyder, T., et al. B Cell Receptor-Mediated Antigen Gathering Requires Ubiquitin Ligase Cbl and Adaptors Grb2 and Dok-3 to Recruit Dynein to the Signaling Microcluster. Immunity. , (2011).
- Wang, J. C., et al. The Rap1 – cofilin-1 pathway coordinates actin reorganization and MTOC polarization at the B cell immune synapse. Journal of Cell Science. , 1094-1109 (2017).
- Fleire, S. J., Goldman, J. P., Carrasco, Y. R., Weber, M., Bray, D., Batista, F. D. B cell ligand discrimination through a spreading and contraction response. Science. 312 (5774), 738-741 (2006).
- Vascotto, F., et al. The actin-based motor protein myosin II regulates MHC class II trafficking and BCR-driven antigen presentation. Journal of Cell Biology. 176 (7), 1007-1019 (2007).
- Reversat, A., et al. Polarity protein Par3 controls B-cell receptor dynamics and antigen extraction at the immune synapse. Molecular biology of the cell. 26 (7), 1273-1285 (2015).
- Lankar, D., et al. Dynamics of Major Histocompatibility Complex Class II Compartments during B Cell Receptor–mediated Cell Activation. The Journal of Experimental Medicine. 195 (4), 461-472 (2002).
- Duchez, S., et al. Reciprocal Polarization of T and B Cells at the Immunological Synapse. The Journal of Immunology. 187 (9), 4571-4580 (2011).
- Pérez-Montesinos, G., et al. Dynamic changes in the intracellular association of selected rab small GTPases with MHC class II and DM during dendritic cell maturation. Frontiers in Immunology. 8 (MAR), 1-15 (2017).
- Le Roux, D., Lankar, D., Yuseff, M. I., Vascotto, F., Yokozeki, T., Faure-Andre´, G., Mougneau, E., Glaichenhaus, N., Manoury, B., Bonnerot, C., Lennon-Dume´nil, A. M. Syk-dependent Actin Dynamics Regulate Endocytic Trafficking and Processing of Antigens Internalized through the B-Cell Receptor. Molecular biology of the cell. 18 (September), 3451-3462 (2007).
- Reber, S. Chapter 8 Isolation of Centrosomes from Cultured Cells. Methods in Molecular Biology. 777 (2), 107-116 (2011).
- Gogendeau, D., Guichard, P., Tassin, A. M. Purification of centrosomes from mammalian cell lines. Methods in Cell Biology. 129, (2015).
- Obino, D., et al. Vamp-7–dependent secretion at the immune synapse regulates antigen extraction and presentation in B-lymphocytes. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 890-897 (2017).
- Harwood, N. E., Batista, F. D. Early Events in B Cell Activation BCR: B cell receptor. Annual Review of Immunology. , (2010).
- Yuseff, M. I., Lennon-Duménil, A. M. B cells use conserved polarity cues to regulate their antigen processing and presentation functions. Frontiers in Immunology. 6, 1-7 (2015).
