Digitale PCR-gebaseerde competitieve index voor high-throughput analyse van de geschiktheid in salmonella
Summary
Deze moleculair gebaseerde aanpak voor het bepalen van bacteriële fitness vergemakkelijkt nauwkeurige en nauwkeurige detectie van micro-organismen met behulp van unieke genomische DNA-barcodes die worden gekwantificeerd via digitale PCR. Het protocol beschrijft de berekening van de concurrerende index voor salmonella stammen; de technologie is echter gemakkelijk aan te passen aan protocollen die absolute kwantificering van enig genetisch-smeedbaar organisme vereisen.
Abstract
Een concurrerende index is een gemeenschappelijke methode die wordt gebruikt om bacteriële conditie en/of virulentie te beoordelen. Het nut van deze aanpak wordt geïllustreerd door haar gemak om uit te voeren en haar vermogen om de geschiktheid van vele stammen te standaardiseren tot een wild-type organisme. De techniek is echter beperkt door beschikbare fenotypische markers en het aantal stammen dat tegelijkertijd kan worden beoordeeld, waardoor een groot aantal replicaatexperimenten nodig is. Gelijktijdig met grote aantallen experimenten zijn de arbeids-en materiaalkosten voor het kwantificeren van bacteriën op basis van fenotypische markers niet onbelangrijk. Om deze negatieve aspecten te overwinnen met behoud van de positieve aspecten, hebben we een moleculaire benadering ontwikkeld om micro-organismen direct te kwantificeren na technische genetische markers op bacteriële chromosomen. Unieke, 25 basepaar DNA-barcodes werden ingebracht op een onschadelijke locus op het chromosoom van wild-type en Mutant stammen van salmonella. In vitro competitie experimenten werden uitgevoerd met behulp van entmateriaal bestaande uit gepoolde stammen. Na de competitie werden de absolute aantallen van elke stam gekwantificeerd met behulp van digitale PCR en werden de concurrerende indices voor elke stam berekend uit die waarden. Uit onze gegevens blijkt dat deze aanpak voor het kwantificeren van salmonella uiterst gevoelig, nauwkeurig en nauwkeurig is voor het opsporen van zowel zeer overvloedige (High fitness) als zeldzame (Low fitness) micro-organismen. Bovendien is deze techniek gemakkelijk aan te passen aan bijna elk organisme met chromosomen dat kan worden gewijzigd, evenals aan verschillende experimentele ontwerpen die absolute kwantificering van micro-organismen vereisen.
Introduction
Het beoordelen van de geschiktheid en virulentie van pathogene organismen is een fundamenteel aspect van microbiologie onderzoek. Hiermee kunnen vergelijkingen worden gemaakt tussen stammen of tussen gemuleerde organismen, waardoor onderzoekers het belang van bepaalde genen onder specifieke omstandigheden kunnen bepalen. Traditioneel gebruikt virulentie beoordeling een dierlijk model van infectie met verschillende bacteriële stammen en het observeren van de uitkomst van het besmette dier (bijv. infectieuze dosis50, letale dosis50, tijd tot overlijden, ernst van het symptoom, gebrek aan symptomen, enz.). Deze procedure biedt waardevolle beschrijvingen van virulentie, maar het vereist stammen om aanzienlijke verschillen in uitkomsten te veroorzaken om variaties van wild type te detecteren. Bovendien zijn de resultaten semi-kwantitatief, omdat, terwijl ziekteprogressie en symptoom ernst in de loop van de tijd subjectief kunnen worden gekwantificeerd, de interpretatie van virulentie vergeleken met wild-type meer kwalitatief is (d.w.z. meer, minder of even virulent). Een gemeenschappelijk alternatief voor het uitvoeren van dierlijke infectiviteit assays is het genereren van concurrerende indices (CIs), waarden die direct vergelijken fitness of virulentie van een stam aan een wild-type tegenhanger in een gemengde infectie1. Deze techniek heeft tal van voordelen ten opzichte van een traditioneel diermodel van infectie door de virulentie te standaardiseren tot een wild type stam en het bepalen van een kwantificeerbare waarde om de mate van verzwakking weer te geven. Deze techniek kan ook worden aangepast om geninteracties in bacteriën te analyseren door het bepalen van een geannuleerde concurrerende index (COI)2. Het berekenen van een COI voor een groep gemuleerde organismen stelt onderzoekers in staat te bepalen of twee genen zelfstandig bijdragen aan pathogenese of als ze betrokken zijn bij dezelfde virulentie route en afhankelijk van elkaar. Bovendien vereist het berekenen van een CI inventarisatie van bacteriën die waardevolle inzichten kunnen geven in de pathogenese van organismen. CIs en COIs stellen onderzoekers ook in staat om Avirulente stammen te onderzoeken die geen klinische ziekte veroorzaken, maar nog steeds verschillen in geschiktheid. Deze techniek wordt beperkt door het gebruik van traditionele antibioticaresistentie markers om stammen te identificeren, waardoor het aantal ingangs stammen beperken tot slechts één of twee tegelijk. Vanwege deze beperking zijn grote aantallen experimentele groepen en replicaten vereist, die naast het toevoegen aan arbeids-en materiaalkosten ook de mogelijkheden voor variabiliteit in experimentele omstandigheden en onnauwkeurige resultaten vergroot. (Voor een grondige beoordeling van de voordelen en toepassingen van het gebruik van gemengde infecties om virulentie, fitness en geninteracties te bestuderen, zie C.R. Beuzón en D.W. Holden 1)
Er zijn pogingen ondernomen om deze beperking te overwinnen, zoals het gebruik van fluorescently gelabelde cellen gekwantificeerd via flow flowcytometrieonderzoeken3,4,5. Deze techniek kwantificeert cellen met behulp van ofwel 1) gelabelde antilichamen tegen fenotypische markers of 2) endogeen geproduceerde fluorescerende eiwitten. Het gebruik van gelabelde antilichamen heeft een aantoonbaarheidsgrens van 1.000 cellen/mL en vereist daarom een groot aantal cellen om3te analyseren. Cellen die fluorescerende eiwitten uitdrukken hebben een veranderde fysiologie en zijn vatbaar voor fitness veranderingen als gevolg van hoge eiwit expressie6. Beide methoden worden beperkt door het aantal fluorescerende markers detecteerbaar met behulp van flow cytometrie. Een vooruitgang in moleculaire kwantificatie werd bereikt door de ontwikkeling van een microarray-techniek die verzwakking ontdekte in 120 stammen van een initiële gemengde infectie van meer dan 1.000 stammen in een Murine model7. Deze techniek gebruikt een microarray analyse van RNA van gemuleerde stammen, wat leidde tot een aanzienlijke variabiliteit in de uitkomst. Niettemin stelde het dat grote groepen van gemengde infecties een nuttig hulpmiddel kunnen zijn en dat met behulp van gevoelige detectietechnieken verschillen in bacteriële virulentie kunnen worden geïdentificeerd. Met de ontwikkeling van de volgende generatie sequencing, breidde TN-SEQ het nut van transposon mutaties uit, wat een krachtige methode mogelijk maakt voor het kwantificeren van bacteriën die willekeurig werden gemuleerd8,9,10, 11. Onlangs is een alternatief protocol ontwikkeld dat de noodzaak van transposons elimineert en in plaats daarvan DNA-barcodes gebruikt om de genomische veranderingen en hun impact op fitness12gemakkelijker te identificeren en bij te houden. Deze technologie is een belangrijke vooruitgang, maar het inbrengen van de genomische barcodes is nog steeds een willekeurig proces. Om de willekeurigheid van eerdere experimenten te overwinnen, ontwikkelde Yoon et al. een methode om het CIs van salmonella stammen te berekenen met behulp van unieke DNA-barcodes die op precieze locaties op de chromosomen van bacteriën13zijn geplaatst. Unieke met stammen werden gedetecteerd met behulp van een qPCR-gebaseerde methode met sybr Green en primers specifiek voor elke unieke barcode. De techniek werd beperkt door de door qPCR opgelegde beperkingen, waaronder verschillen in primer-efficiëntie en lage gevoeligheid, wat blijkt uit de noodzaak van geneste PCR voorafgaand aan qPCR. Niettemin heeft deze benadering aangetoond dat gerichte genomische modificaties kunnen worden benut voor het opsporen en mogelijk kwantificeren van Pools van meerdere bacteriële stammen.
In het volgende protocol beschrijven we een nieuwe methodologie om bacteriële concurrentie experimenten uit te voeren met grote Pools van gemengde entmateriaal, gevolgd door nauwkeurige kwantificering met behulp van een zeer gevoelige digitale PCR-techniek. Het protocol omvat het genetisch labelen van bacteriële stammen met een unieke DNA-Barcode ingevoegd op een onschadelijke regio van het chromosoom. Deze modificatie maakt het mogelijk om stammen snel en nauwkeurig te kwantificeren met behulp van moderne moleculaire technologie in plaats van traditionele seriële verdunningen, replica plating, en tellen kolonie vormende eenheden die afhankelijk zijn van fenotypische markers (d.w.z. antibioticaresistentie ). De wijzigingen maken gelijktijdige beoordeling van vele stammen in één gegroepeerd entmateriaal mogelijk, waardoor de mogelijkheid van experimentele variabiliteit aanzienlijk wordt verminderd, omdat alle stammen aan exact dezelfde voorwaarden worden blootgesteld. Bovendien, terwijl deze techniek werd ontwikkeld in salmonella heliobacter Serovar typhimurium, het is zeer aanpasbaar aan een genetisch smeedbaar organisme en bijna elk experimenteel ontwerp waar nauwkeurige bacteriële tellingen zijn vereist, het verstrekken van een nieuwe tool om de nauwkeurigheid en doorvoer in microbiologie laboratoria te verhogen zonder de beperkingen opgelegd door eerdere methoden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het vermogen om micro-organismen nauwkeurig te kwantificeren is van het allergrootste belang voor microbiologie onderzoek, en het vermogen om unieke stammen van een eerste gemengde populatie te inventariseren is een waardevol instrument gebleken voor het beoordelen van de eigenschappen van fitness en virulentie in Bacteriën. De technieken om dit te verwezenlijken zijn echter niet in tempo gevorderd met de moderne ontwikkelingen in de moleculaire biologie. De technologie om de chromosomen van vele bacteriën gemakkelijk …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het onderzoek dat in deze uitgave werd gerapporteerd, werd gesteund door het onderzoeksfonds George F. Haddix president en het National Institute of General Medical Science van de National Institutes of Health (NIH) onder het awardnummer GM103427. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22600028 | Procure from any manufacturer |
| 16 mL culture tubes | MidSci | 8599 | Procure from any manufacturer |
| 5-200 μL pipette tips | RAININ | 30389241 | Procure alternative tip brands with caution based on manufacturing quality |
| 5-50 μL multichannel pipette | RAININ | 17013804 | Use alternative multichannel pipettes with caution |
| Agarose | ThermoFisher Scientific | BP160-500 | Procure from any manufacturer |
| BLAST Analysis | NCBI | N/A | https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi |
| C1000 Touch Thermocycler with 96-Deep Well Reaction Module | Bio Rad | 1851197 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Chemically competent DH5α | Invitrogen | 18258012 | Procure from any manufacturer or prepare yourself |
| Chloramphenicol | ThermoFisher Scientific | BP904-100 | Procure from any manufacturer |
| Cytation5 Microplate reader | BioTek | CYT5MF | Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA |
| Data Analysis Software (QuantaSoft and QuantaSoft Data Analysis Pro) | Bio Rad | N/A | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio Rad | 12001925 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio Rad | 1863004 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Bio Rad | 1863024 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet Generator | Bio Rad | 1864008 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet Generator | Bio Rad | 1863009 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Droplet Generation Oil for Probes | Bio Rad | 1863005 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Kanamycin | ThermoFisher Scientific | BP906-5 | Procure from any manufacturer |
| Luria-Bertani agar | ThermoFisher Scientific | BP1425-2 | Procure from any manufacturer or make it yourself from agar, tryptone, yeast digest, and NaCl |
| Luria-Bertani broth | ThermoFisher Scientific | BP1426-2 | Procure from any manufacturer or make it yourself from tryptone, yeast digest, and NaCl |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio Rad | 1814040 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| PCR Tubes | Eppendorf | 951010022 | Procure from any manufacturer |
| Petri dishes | ThermoFisher Scientific | FB0875712 | Procure from any manufacturer |
| pPCR Script Cam SK+ | Stratagene/Agilent | 211192 | No longer available commercially |
| Primer/Probe Design | IDT | N/A | https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index |
| pSKAP and pSKAP_Barcodes | Addgene | Plasmid numbers 122702-122726 | www.addgene.org |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio Rad | 1814000 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| QX200 Droplet Generator | Bio Rad | 1864002 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| QX200 Droplet Reader | Bio Rad | 1864003 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| S. Typhimurium strain ATCC 14028s | ATCC | ATCC 14028s | www.atcc.org |
| Take3 Micro-Volume Plate | BioTek | TAKE3 | Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA |
| Thermo Scientific FastDigest BamHI | ThermoFisher Scientific | FERFD0054 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific FastDigest DpnI | ThermoFisher Scientific | FERFD1704 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific FastDigest HindIII | ThermoFisher Scientific | FERFD0504 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific GeneJet Gel Extraction and DNA Cleanup Micro Kit | ThermoFisher Scientific | FERK0832 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific GeneJet Miniprep Kit | ThermoFisher Scientific | FERK0503 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F534L | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific T4 DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | FEREL0011 | Procure from any manufacturer |
| Thermocycler | Bio Rad | 1861096 | Procure from any manufacturer |
| UVP Visi-Blue Transilluminator | ThermoFisher Scientific | UV95043301 | Or other transiluminator that allows visualization of DNA |
| Water, Molecular Biology Grade | ThermoFisher Scientific | BP28191 | Procure from any manufacturer |
References
- Beuzón, C. R., Holden, D. W. Use of mixed infections with Salmonella strains to study virulence genes and their interactions in vivo. Microbes and Infection. 3 (14-15), 1345-1352 (2001).
- Bäumler, A. J., Tsolis, R. M., Valentine, P. J., Ficht, T. A., Heffron, F. Synergistic effect of mutations in invA and lpfC on the ability of Salmonella typhimurium to cause murine typhoid. Infection and Immunity. 65 (6), 2254-2259 (1997).
- Vital, M., Hammes, F., Egli, T. Competition of Escherichia coli O157 with a drinking water bacterial community at low nutrient concentrations. Water Research. 46 (19), 6279-6290 (2012).
- Schellenberg, J., Smoragiewicz, W., Karska-Wysocki, B. A rapid method combining immunofluorescence and flow cytometry for improved understanding of competitive interactions between lactic acid bacteria (LAB) and methicillin-resistant S. aureus (MRSA) in mixed culture. Journal of Microbiological Methods. 65 (1), 1-9 (2006).
- Becker, D., et al. Robust Salmonella metabolism limits possibilities for new antimicrobials. Nature. 440 (7082), 303 (2006).
- Rang, C., Galen, J. E., Kaper, J. B., Chao, L. Fitness cost of the green fluorescent protein in gastrointestinal bacteria. Canadian Journal of Microbiology. 49 (9), 531-537 (2003).
- Santiviago, C. A., et al. Analysis of pools of targeted Salmonella deletion mutants identifies novel genes affecting fitness during competitive infection in mice. PLoS Pathogens. 5 (7), e1000477 (2009).
- Ahmer, B. M., Gunn, J. S. Interaction of Salmonella spp. with the intestinal microbiota. Frontiers in Microbiology. 2, 101 (2011).
- Gallagher, L. A., Shendure, J., Manoil, C. Genome-scale identification of resistance functions in Pseudomonas aeruginosa using Tn-seq. MBio. 2 (1), (2011).
- Van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nature Methods. 6 (10), 767 (2009).
- van Opijnen, T., Lazinski, D. W., Camilli, A. Genome‐wide fitness and genetic interactions determined by Tn‐seq, a high‐throughput massively parallel sequencing method for microorganisms. Current Protocols in Microbiology. 36 (1), (2017).
- Mutalik, V. K., et al. Dual-barcoded shotgun expression library sequencing for high-throughput characterization of functional traits in bacteria. Nature Communications. 10 (1), 308 (2019).
- Yoon, H., Gros, P., Heffron, F. Quantitative PCR-based competitive index for high-throughput screening of Salmonella virulence factors. Infection and Immunity. 79 (1), 360-368 (2011).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6640-6645 (2000).
- Henard, C. A., Bourret, T. J., Song, M., Vázquez-Torres, A. Control of redox balance by the stringent response regulatory protein promotes antioxidant defenses of Salmonella. Journal of Biological Chemistry. 285 (47), 36785-36793 (2010).
- Poteete, A. R., Fenton, A. C. λ red-dependent growth and recombination of phage P22. Virology. 134 (1), 161-167 (1984).
- McCollister, B. D., Bourret, T. J., Gill, R., Jones-Carson, J., Vázquez-Torres, A. Repression of SPI2 transcription by nitric oxide-producing, IFNγ-activated macrophages promotes maturation of Salmonella phagosomes. Journal of Experimental Medicine. 202 (5), 625-635 (2005).
- Shaw, J. A., et al. Salmonella enterica serovar Typhimurium has three transketolase enzymes contributing to the pentose phosphate pathway. Journal of Biological Chemistry. 293 (29), 11271-11282 (2018).
- Freter, R., O’Brien, P., Macsai, M. S. Role of chemotaxis in the association of motile bacteria with intestinal mucosa: in vivo studies. Infection and immunity. 34 (1), 234-240 (1981).
- Taylor, R. K., Miller, V. L., Furlong, D. B., Mekalanos, J. J. Use of phoA gene fusions to identify a pilus colonization factor coordinately regulated with cholera toxin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (9), 2833-2837 (1987).
- Nogva, H. K., Dromtorp, S., Nissen, H., Rudi, K. Ethidium monoazide for DNA-based differentiation of viable and dead bacteria by 5′-nuclease PCR. Biotechniques. 34 (4), 804-813 (2003).
- Nocker, A., Camper, A. K. Novel approaches toward preferential detection of viable cells using nucleic acid amplification techniques. FEMS Microbiology Letters. 291 (2), 137-142 (2009).
- Nocker, A., Cheung, C. -. Y., Camper, A. K. Comparison of propidium monoazide with ethidium monoazide for differentiation of live vs. dead bacteria by selective removal of DNA from dead cells. Journal of Microbiological Methods. 67 (2), 310-320 (2006).
- Nocker, A., Mazza, A., Masson, L., Camper, A. K., Brousseau, R. Selective detection of live bacteria combining propidium monoazide sample treatment with microarray technology. Journal of Microbiological Methods. 76 (3), 253-261 (2009).
- Nocker, A., Sossa, K. E., Camper, A. K. Molecular monitoring of disinfection efficacy using propidium monoazide in combination with quantitative PCR. Journal of Microbiological Methods. 70 (2), 252-260 (2007).
- Nocker, A., Sossa-Fernandez, P., Burr, M. D., Camper, A. K. Use of propidium monoazide for live/dead distinction in microbial ecology. Applied and Environmental Microbiology. 73 (16), 5111-5117 (2007).
- Price-Carter, M., Tingey, J., Bobik, T. A., Roth, J. R. The Alternative Electron Acceptor Tetrathionate Supports B12-Dependent Anaerobic Growth ofSalmonella enterica Serovar Typhimurium on Ethanolamine or 1, 2-Propanediol. Journal of Bacteriology. 183 (8), 2463-2475 (2001).
- Taylor, R. G., Walker, D. C., McInnes, R. E. coli host strains significantly affect the quality of small scale plasmid DNA preparations used for sequencing. Nucleic Acids Research. 21 (7), 1677 (1993).
- Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. Gene disruption in Escherichia coli: Tc R and Km R cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene. 158 (1), 9-14 (1995).
