Índice competitivo baseado em PCR digital para análise de alta produtividade de aptidão em Salmonella
Summary
Esta aproximação molecular-baseada para determinar a aptidão bacteriana facilita a deteção exata e exata dos micro-organismos usando os códigos de barras genomic originais do ADN que são quantificados através do PCR digital. O protocolo descreve o cálculo do índice competitivo para cepas de Salmonella ; Entretanto, a tecnologia é prontamente adaptável aos protocolos que exigem a quantificação absoluta de todo o organismo genetically-maleável.
Abstract
Um índice competitivo é um método comum usado para avaliar a aptidão bacteriana e/ou virulência. A utilidade desta aproximação é exemplificada por sua facilidade executar e sua habilidade de padronizar a aptidão de muitas tensões a um selvagem-tipo organismo. A técnica é limitada, no entanto, por marcadores fenotípicos disponíveis e o número de cepas que podem ser avaliados simultaneamente, criando a necessidade de um grande número de experimentos replicantes. Em simultâneo com um grande número de experimentos, os custos laborais e materiais para quantificar as bactérias com base em marcadores fenotípicos não são insignificantes. Para superar esses aspectos negativos, mantendo os aspectos positivos, desenvolvemos uma abordagem molecular para quantificar diretamente os microrganismos após marcadores genéticos de engenharia em cromossomas bacterianos. Únicos, 25 códigos de barras do ADN do par baixo foram introduzidos em um locus inócuo no cromossoma de estirpes do selvagem-tipo e do mutante das salmonelas. Experimentos de competição in vitro foram realizados usando inóculos consistindo de cepas agrupadas. Após a competição, os números absolutos de cada cepa foram quantificados por meio de PCR digital e os índices competitivos para cada cepa foram calculados a partir desses valores. Nossos dados indicam que essa abordagem para quantificar a Salmonella é extremamente sensível, precisa e precisa para detectar microrganismos altamente abundantes (de alta aptidão) e raros (baixa aptidão). Adicionalmente, esta técnica é facilmente adaptável a quase todo o organismo com os cromossomas capazes da modificação, assim como aos vários projetos experimentais que exigem a quantificação absoluta dos micro-organismos.
Introduction
Avaliar a aptidão e a virulência de organismos patogénicos é um aspecto fundamental da pesquisa em microbiologia. Permite comparações entre cepas ou entre organismos mutantes, o que permite que os pesquisadores determinem a importância de determinados genes em condições específicas. Tradicionalmente, a avaliação de virulência utiliza um modelo animal de infecção usando diferentes cepas bacterianas e observando o resultado do animal infectado (por exemplo, dose infecciosa50, dose letal50, tempo até a morte, gravidade dos sintomas, falta de sintomas, etc.). Este procedimento fornece descrições valiosas da virulência, mas exige que as tensões causem diferenças consideráveis nos resultados a fim detectar variações do selvagem-tipo. Além disso, os resultados são semiquantitativos, pois enquanto a progressão da doença e a gravidade dos sintomas podem ser quantificadas subjetivamente ao longo do tempo, a interpretação da virulência comparada ao tipo selvagem é mais qualitativa (ou seja, mais, menos ou igualmente virulenta). Uma alternativa comum à realização de ensaios de infectividade animal é gerar índices competitivos (CIs), valores que comparam diretamente a aptidão ou a virulência de uma cepa a uma contraparte de tipo selvagem em uma infecção mista1. Esta técnica tem inúmeras vantagens sobre um modelo animal tradicional de infecção, padronando a virulência para uma estirpe de tipo selvagem e determinando um valor quantificável para refletir o grau de atenuação. Esta técnica também pode ser adaptada para analisar as interações genéticas em bactérias, determinando um índice competitivo cancelado (COI)2. O cálculo de um COI para um grupo de organismos mutados permite que os pesquisadores determinem se dois genes contribuem de forma independente para a patogênese ou se estão envolvidos na mesma via de virulência e dependem uns dos outros. Adicionalmente, calcular um CI exige a enumeração das bactérias que podem fornecer introspecções valiosas na patogénese dos organismos. CIs e COIs também permitem que os pesquisadores para jumentos avirulent cepas que não causam doença clínica, mas ainda têm diferenças na aptidão. Esta técnica é limitada pelo uso de marcadores tradicionais de resistência a antibióticos para identificar cepas, limitando assim o número de cepas de entrada para apenas um ou dois de cada vez. Devido a essa limitação, é necessário um grande número de grupos experimentais e repetições, o que, além de acrescentar aos custos trabalhistas e materiais, também aumenta as oportunidades de variabilidade em condições experimentais e resultados imprecisos. (Para uma revisão minuciosa dos benefícios e aplicações do uso de infecções mistas para estudar a virulência, a aptidão e as interações genéticas, ver C.R. Beuzón e DW Holden 1)
As tentativas foram feitas para superar esta limitação, tal como o uso de pilhas fluorescently-etiquetadas quantificadas através da citometria de fluxo3,4,5. Esta técnica quantifica as células usando 1) anticorpos rotulados para marcadores fenotípicos ou 2) proteínas fluorescentes produzidas endogenamente. O uso de anticorpos rotulados tem um limite de detecção de 1.000 células/mL e, portanto, requer um elevado número de células para analisar3. As células que expressam proteínas fluorescentes têm uma fisiologia alterada e são suscetíveis a alterações de aptidão resultantes da alta expressão protéica6. Ambos os métodos são limitados pelo número de marcadores fluorescentes detectável usando a citometria de fluxo. Um avanço na quantificação molecular foi conseguido com o desenvolvimento de uma técnica do microarray que detectaram a atenuação em 120 tensões de uma infecção misturada inicial sobre de 1.000 tensões em um modelo murino7. Esta técnica utilizou uma análise do microarray do RNA das tensões mutado, que conduzem à variabilidade considerável no resultado. Não obstante, estabeleceu que as grandes associações de infecções misturadas podem ser uma ferramenta útil e que utilizando técnicas sensíveis da deteção, as diferenças na virulência bacteriana podem ser identificadas. Com o desenvolvimento do sequenciamento da próxima geração, TN-Seq expandiu a utilidade das mutações de transposon, possibilitando um método potente para quantificar as bactérias que foram aleatoriamente mutadas8,9,10, o 11. Um protocolo alternativo foi desenvolvido recentemente que elimina a necessidade para transposons e usa preferivelmente códigos de barras do ADN para identificar mais facilmente e controlar mudanças genomic e seu impacto na aptidão12. Esta tecnologia é um avanço importante, mas a inserção dos códigos de barras genômicos ainda é um processo aleatório. Para superar a aleatoriedade de experimentos anteriores, Yoon et al. desenvolveram um método para calcular os CIs de cepas de Salmonella usando códigos de barras de DNA únicos inseridos em locais precisos sobre os cromossomas das bactérias13. Cepas com código de barras exclusivas foram detectadas usando um método baseado em qPCR com verde SYBR e primers específicos para cada código de barras exclusivo. A técnica foi limitada por restrições impostas pela qPCR, incluindo diferenças na eficiência da cartilha e baixa sensibilidade, evidenciadas pela necessidade de Nested-PCR antes da qPCR. Não obstante, esta aproximação demonstrou que as modificações genomic alvejadas poderiam ser exploradas para detectar e potencialmente quantificar associações de tensões bacterianas múltiplas.
No seguinte protocolo, nós descrevemos uma metodologia nova para executar experimentos bacterianos da competição com as grandes associações do inóculos misturado seguidas pela quantificação exata usando uma técnica digital altamente sensível do PCR. O protocolo envolve cepas bacterianas geneticamente rotuladoras com um código de barras de DNA único inserido em uma região inócuo do cromossomo. Esta modificação permite que as tensões sejam rapidamente e precisamente quantificadas usando a tecnologia molecular moderna em vez das diluições seriais tradicionais, do chapeamento da réplica, e da contagem de unidades formando da colônia que dependem dos marcadores fenotípicos (isto é resistência antibiótica ). As modificações permitem a avaliação simultânea de muitas cepas em um único inoculto agrupada, reduzindo substancialmente a possibilidade de variabilidade experimental, pois todas as cepas são expostas às mesmas condições exatas. Além disso, enquanto esta técnica foi desenvolvida em Salmonella enterica sorovar typhimurium, é altamente adaptável a qualquer organismo geneticamente maleável e quase qualquer experimento experimental onde são necessárias contagens bacterianas precisas, proporcionando uma nova ferramenta para aumentar a exatidão e a taxa de transferência em laboratórios da microbiologia sem as limitações impostas por métodos precedentes.
Protocol
Representative Results
Discussion
A capacidade de quantificar com precisão os microrganismos é de suma importância para a pesquisa de microbiologia, e a capacidade de enumerar cepas únicas de uma população mista inicial provou ser uma ferramenta inestimável para avaliar os traços de aptidão e virulência em Bactérias. No entanto, as técnicas para realizar isso não progrediram em ritmo com os desenvolvimentos modernos em biologia molecular. A tecnologia para modificar facilmente os cromossomas de muitas bactérias, incluindo S. Typhim…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
As pesquisas relatadas nesta publicação foram apoiadas pelo fundo de pesquisa do corpo docente do Presidente George F. Haddix e pelo Instituto Nacional de ciências médicas gerais dos institutos nacionais de saúde (NIH) o prêmio número GM103427. O conteúdo é unicamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente os pontos de vista oficiais dos institutos nacionais de saúde.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22600028 | Procure from any manufacturer |
| 16 mL culture tubes | MidSci | 8599 | Procure from any manufacturer |
| 5-200 μL pipette tips | RAININ | 30389241 | Procure alternative tip brands with caution based on manufacturing quality |
| 5-50 μL multichannel pipette | RAININ | 17013804 | Use alternative multichannel pipettes with caution |
| Agarose | ThermoFisher Scientific | BP160-500 | Procure from any manufacturer |
| BLAST Analysis | NCBI | N/A | https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi |
| C1000 Touch Thermocycler with 96-Deep Well Reaction Module | Bio Rad | 1851197 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Chemically competent DH5α | Invitrogen | 18258012 | Procure from any manufacturer or prepare yourself |
| Chloramphenicol | ThermoFisher Scientific | BP904-100 | Procure from any manufacturer |
| Cytation5 Microplate reader | BioTek | CYT5MF | Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA |
| Data Analysis Software (QuantaSoft and QuantaSoft Data Analysis Pro) | Bio Rad | N/A | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio Rad | 12001925 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio Rad | 1863004 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Bio Rad | 1863024 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet Generator | Bio Rad | 1864008 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet Generator | Bio Rad | 1863009 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Droplet Generation Oil for Probes | Bio Rad | 1863005 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Kanamycin | ThermoFisher Scientific | BP906-5 | Procure from any manufacturer |
| Luria-Bertani agar | ThermoFisher Scientific | BP1425-2 | Procure from any manufacturer or make it yourself from agar, tryptone, yeast digest, and NaCl |
| Luria-Bertani broth | ThermoFisher Scientific | BP1426-2 | Procure from any manufacturer or make it yourself from tryptone, yeast digest, and NaCl |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio Rad | 1814040 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| PCR Tubes | Eppendorf | 951010022 | Procure from any manufacturer |
| Petri dishes | ThermoFisher Scientific | FB0875712 | Procure from any manufacturer |
| pPCR Script Cam SK+ | Stratagene/Agilent | 211192 | No longer available commercially |
| Primer/Probe Design | IDT | N/A | https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index |
| pSKAP and pSKAP_Barcodes | Addgene | Plasmid numbers 122702-122726 | www.addgene.org |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio Rad | 1814000 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| QX200 Droplet Generator | Bio Rad | 1864002 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| QX200 Droplet Reader | Bio Rad | 1864003 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| S. Typhimurium strain ATCC 14028s | ATCC | ATCC 14028s | www.atcc.org |
| Take3 Micro-Volume Plate | BioTek | TAKE3 | Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA |
| Thermo Scientific FastDigest BamHI | ThermoFisher Scientific | FERFD0054 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific FastDigest DpnI | ThermoFisher Scientific | FERFD1704 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific FastDigest HindIII | ThermoFisher Scientific | FERFD0504 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific GeneJet Gel Extraction and DNA Cleanup Micro Kit | ThermoFisher Scientific | FERK0832 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific GeneJet Miniprep Kit | ThermoFisher Scientific | FERK0503 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F534L | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific T4 DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | FEREL0011 | Procure from any manufacturer |
| Thermocycler | Bio Rad | 1861096 | Procure from any manufacturer |
| UVP Visi-Blue Transilluminator | ThermoFisher Scientific | UV95043301 | Or other transiluminator that allows visualization of DNA |
| Water, Molecular Biology Grade | ThermoFisher Scientific | BP28191 | Procure from any manufacturer |
References
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