Salmonella Fitness yüksek verimlilik analizi için dijital PCR tabanlı rekabetçi endeksi
Summary
Bakteriyel Fitness belirlenmesi için bu moleküler tabanlı yaklaşım dijital PCR üzerinden nicelik benzersiz genomik DNA barkodları kullanarak mikroorganizmaların kesin ve doğru algılanmasını kolaylaştırır. Protokol, Salmonella suşları için rekabetçi dizinin hesaplanmasında açıklanmaktadır; Ancak, teknoloji, herhangi bir genetiği değiştirilmiş organizmanın mutlak ölçümlerini gerektiren protokollere kolayca adapte olmaktadır.
Abstract
Rekabetçi bir endeks, bakteriyel Fitness ve/veya virulence değerlendirmek için kullanılan ortak bir yöntemdir. Bu yaklaşımın yarar gerçekleştirmek için kolaylığı ve bir vahşi tip organizmaya birçok suşların Fitness standartlaştırmak yeteneği tarafından örneklenmiştir. Teknik, ancak, mevcut fenotipi belirteçler ve aynı anda değerlendirilebilir suşların sayısı tarafından, çoğaltır deneyler çok sayıda ihtiyacı oluşturarak sınırlıdır. Çok sayıda deney ile eşzamanlı olarak, fenotipik işaretçileri dayalı bakterilerin ölçülmesini için işçilik ve malzeme maliyetleri önemsiz değildir. Olumlu yönlerini koruyarak bu olumsuz yönlerini aşmak için, bakteri kromozomları üzerine genetik belirteçleri mühendislik sonra doğrudan mikroorganizmalar ölçmek için moleküler tabanlı bir yaklaşım geliştirdik. Benzersiz, 25 baz çifti DNA barkodları, yaban tipi ve Salmonellamutant suşlarının kromozom üzerinde bir zararsız Locus yerleştirilir. In vitro rekabet denemeleri, havuzlanmış suşlardan oluşan inocula kullanılarak yapılmıştır. Rekabetin ardından, her bir gerilimin mutlak sayısı dijital PCR kullanılarak ölçülebilir ve her bir gerinim için rekabetçi endeksleri bu değerlerden hesaplanır. Verilerimiz, Salmonella ‘yı ölçmek için bu yaklaşımın, hem son derece bol (yüksek Fitness) hem de nadir (düşük Fitness) mikroorganizmaları tespit etmek için son derece hassas, doğru ve hassas olduğunu göstermektedir. Buna ek olarak, bu teknik, neredeyse herhangi bir organizmaya modifikasyon yapabilen kromozomlar ve mikroorganizmaların mutlak ölçülmesini gerektiren çeşitli Deneysel tasarımlar için kolayca uyarlanabilir.
Introduction
Patojen organizmaların Fitness ve virulinin değerlendirilmesi Mikrobiyoloji araştırmalarının temel bir özelliğidir. Bu karşılaştırmalar suşları veya mutasyona uğramış organizmalar arasında yapılması için, hangi araştırmacılar belirli koşullarda belirli genlerin önemini belirlemek için izin verir. Geleneksel olarak, virülans değerlendirmesi farklı bakteriyel suşları kullanarak enfeksiyon bir hayvan modeli kullanır ve enfekte hayvanın sonucunu gözlemlemek (örneğin bulaşıcı doz50, ölümcül doz50, ölüm zamanı, belirti şiddeti, eksikliği Belirtiler, vb.). Bu prosedür, virulence değerli açıklamaları sağlar, ancak vahşi türde varyasyonları algılamak için sonuçlar önemli farklılıklar neden suşları gerektirir. Ayrıca, sonuçlar yarı niceliksel çünkü hastalık ilerlemesi ve semptom şiddeti zaman içinde subjektif olarak niceleyilebilir, vahşi türe kıyasla virülans yorumu daha niteliksel (yani daha fazla, daha az veya eşit derecede virlan). Hayvan infeksiyonunun gerçekleştirilmesi için ortak bir alternatif, rekabetçi Endeksleri (BDT), doğrudan Fitness ya da bir gerinlik virülans karma bir enfeksiyon bir vahşi tip mevkidaşı karşılaştırmak değerleri oluşturmak için1. Bu teknik, vahşi tip bir gerinim için virülans standardizasyon ve zayıflatma derecesini yansıtacak şekilde ölçülebilir bir değer belirleme tarafından enfeksiyon geleneksel hayvan modeli üzerinde sayısız avantajları vardır. Bu teknik, iptal edilmiş bir rekabetçi Endeks (COı)2belirlenerek bakterilerde gen etkileşimlerini analiz etmek için de adapte edilebilir. Bir COI ‘nin bir grup mutasyona uğramış organizmalar için hesaplanması, araştırmacılar iki genin bağımsız olarak patogeneze katkıda bulunup bulunmadığını ya da aynı virülans yoluna katılıp birbirlerine bağımlı olup olmadığını belirlemesine olanak tanır. Ayrıca, bir CI hesaplanması, organizmaların patogenezine değerli Öngörüler sağlayan bakterilerin numaralandırılmasını gerektirir. BDT ve COIs de araştırmacılar klinik hastalığa neden olmayan ama hala Fitness farklılıkları var avirlan suşları asses izin. Bu teknik, suşları tanımlamak için geleneksel antibiyotik direnci belirteçlerinin kullanımı ile sınırlıdır, böylece giriş suşlarının sayısını aynı anda sadece bir ya da iki kez sınırlandırır. Bu sınırlama nedeniyle, çok sayıda deneysel grup ve çoğaltır gereklidir, bu da işçilik ve malzeme maliyetlerine ilaveye ek olarak, deneysel koşullarda değişkenlik ve hatalı sonuçlar için fırsatları da arttırır. (Virulence, Fitness ve gen etkileşimlerini incelemek için karışık enfeksiyonlar kullanmanın faydaları ve uygulamalarının kapsamlı bir gözden geçirilmesi için, bkz: CR Beuzón ve D.W. Holden 1)
Akış cytometri3,4,5ile niceli floresan etiketli hücrelerin kullanımı gibi bu sınırlamanın üstesinden gelmek için girişimleri yapılmıştır. Bu teknik, 1 ‘ i kullanarak hücreleri ölçülebilir) fenotipik işaretçileri veya 2) endojenously üretilen floresan proteinleri etiketli antikorlar. Etiketli antikorların kullanımı 1.000 hücre/mL algılama sınırı vardır ve bu nedenle3analiz etmek için hücre yüksek sayıda gerektirir. Floresan proteinlerini ifade eden hücreler değiştirilmiş bir fizyolojisine sahiptir ve yüksek protein ifadesi6‘ dan kaynaklanan Fitness değişikliklerine duyarlıdır. Her iki yöntem de Akış sitometrisi kullanılarak algılanabilir floresan belirteçleri sayısı ile sınırlıdır. Bir duvar modeli7‘ de 1.000 suşlarının ilk karma enfeksiyonundan 120 suşlarında zayıflama tespit eden bir Mikroarray tekniğinin gelişimi ile moleküler ölçüte bir gelişme elde edildi. Bu teknik, sonuç olarak önemli değişkenlik sağlayan mutasyona uğramış suşlarından RNA ‘nın Mikroarray analizini kullandı. Yine de, karışık enfeksiyonların büyük havuzları yararlı bir araç olabilir ve hassas algılama teknikleri kullanarak, bakteriyel virülans farklılıkları tespit edilebilir kuruldu. Yeni nesil sıralamanın geliştirilmesi ile, TN-Seq transpozon mutasyonların yardımcı programını genişletti ve rasgele mutasyona uğramış bakteri ölçümü için güçlü bir yöntem sağlayan8,9,10, 11‘ den itibaren. Alternatif bir protokol son zamanlarda Transpozonlar ihtiyacını ortadan kaldırır ve bunun yerine daha kolay tanımlamak ve genomik değişiklikleri ve fitness üzerindeki etkilerini izlemek için DNA barkodları kullanır geliştirilmiştir12. Bu teknoloji büyük bir ilerlemedir, ancak genomik barkodların eklenmesi hala rasgele bir süreçtir. Önceki deneylerin rastgele üstesinden gelmek için, Yoon et al. bakterilerin kromozomları üzerinde kesin yerlere yerleştirilen benzersiz DNA barkodları kullanarak Salmonella suşlarının BDT ‘sını hesaplamak için bir yöntem geliştirdi13. Benzersiz barkodlu suşlar, SYBR yeşil ve her benzersiz barkodan spesifik astar içeren qPCR tabanlı bir yöntem kullanılarak saptandı. Bu teknik, qPCR ‘den önceki iç içe-PCR ihtiyacının kanıtlandığı primer verimlilikler ve düşük hassasiyette farklılıklar da dahil olmak üzere KSC tarafından uygulanan kısıtlamalarla sınırlıdır. Yine de bu yaklaşım, hedeflenen genomik değişikliklerin, birden fazla bakteriyel suşların havuzlarını tespit etmek ve potansiyel olarak ölçmek için yararlanabileceğini göstermiştir.
Aşağıdaki protokolde, son derece hassas bir dijital PCR tekniği kullanarak büyük karışık inokula havuzları ve ardından doğru ölçüte sahip bakteriyel rekabet denemeleri yapmak için yeni bir metodoloji tarif ediyoruz. Protokol, kromozom bir zararsız bölgeye yerleştirilen benzersiz bir DNA barkod ile genetik etiketleme bakteriyel suşları içerir. Bu değişiklik suşları hızlı ve doğru geleneksel seri seyreltme yerine modern moleküler teknoloji kullanarak nicelik sağlar, yineleme kaplama, ve fenotipik belirteçler (yani antibiyotik direnci güveniyor koloninin şekillendirme birimleri sayma ). Değişiklikler, tek bir havuza alınan inokulum içinde birçok suşların eşzamanlı değerlendirilmesi için izin, önemli ölçüde tüm suşları tam aynı koşullara maruz çünkü deneysel değişkenlik olasılığını azaltır. Ayrıca bu teknik Salmonella enterica serovar typhimurium ‘da geliştirilirken, herhangi bir genetik olarak kötü hale gelebilen organizmaya ve doğru bakteriyel sayılarının gerekli olduğu neredeyse her deneysel tasarıma son derece uyarlanabilir, yeni bir önceki yöntemlerle uygulanan kısıtlamalar olmadan Mikrobiyoloji laboratuvarlarında doğruluğu ve verimi artırmak için bir araçtır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mikroorganizmaların doğru şekilde ölçülmesine yönelik yetenek, mikrobiyoloji araştırmaları için önemli bir öneme sahiptir ve ilk karma nüfusun benzersiz suşları numaralandırılması, Fitness ve virülans özelliklerini değerlendirmek için paha biçilmez bir araç olduğunu kanıtladı Bakteri. Ancak, bunu gerçekleştirmek için teknikler moleküler biyoloji modern gelişmeler ile ilerlemedi değil. Birçok bakterinin kromozomları kolayca değiştirmek için teknoloji, S dahil . Typhimurium, …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu yayında rapor edilen araştırma, George F. Haddix Cumhurbaşkanı fakülte Araştırma Fonu ve Ulusal Sağlık Enstitüsü Genel tıp bilimi (NıH) tarafından GM103427 ödül numarası uyarınca desteklenmektedir. İçerik sadece yazarlar sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmez.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22600028 | Procure from any manufacturer |
| 16 mL culture tubes | MidSci | 8599 | Procure from any manufacturer |
| 5-200 μL pipette tips | RAININ | 30389241 | Procure alternative tip brands with caution based on manufacturing quality |
| 5-50 μL multichannel pipette | RAININ | 17013804 | Use alternative multichannel pipettes with caution |
| Agarose | ThermoFisher Scientific | BP160-500 | Procure from any manufacturer |
| BLAST Analysis | NCBI | N/A | https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi |
| C1000 Touch Thermocycler with 96-Deep Well Reaction Module | Bio Rad | 1851197 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Chemically competent DH5α | Invitrogen | 18258012 | Procure from any manufacturer or prepare yourself |
| Chloramphenicol | ThermoFisher Scientific | BP904-100 | Procure from any manufacturer |
| Cytation5 Microplate reader | BioTek | CYT5MF | Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA |
| Data Analysis Software (QuantaSoft and QuantaSoft Data Analysis Pro) | Bio Rad | N/A | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio Rad | 12001925 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio Rad | 1863004 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Bio Rad | 1863024 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet Generator | Bio Rad | 1864008 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet Generator | Bio Rad | 1863009 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Droplet Generation Oil for Probes | Bio Rad | 1863005 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Kanamycin | ThermoFisher Scientific | BP906-5 | Procure from any manufacturer |
| Luria-Bertani agar | ThermoFisher Scientific | BP1425-2 | Procure from any manufacturer or make it yourself from agar, tryptone, yeast digest, and NaCl |
| Luria-Bertani broth | ThermoFisher Scientific | BP1426-2 | Procure from any manufacturer or make it yourself from tryptone, yeast digest, and NaCl |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio Rad | 1814040 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| PCR Tubes | Eppendorf | 951010022 | Procure from any manufacturer |
| Petri dishes | ThermoFisher Scientific | FB0875712 | Procure from any manufacturer |
| pPCR Script Cam SK+ | Stratagene/Agilent | 211192 | No longer available commercially |
| Primer/Probe Design | IDT | N/A | https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index |
| pSKAP and pSKAP_Barcodes | Addgene | Plasmid numbers 122702-122726 | www.addgene.org |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio Rad | 1814000 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| QX200 Droplet Generator | Bio Rad | 1864002 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| QX200 Droplet Reader | Bio Rad | 1864003 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| S. Typhimurium strain ATCC 14028s | ATCC | ATCC 14028s | www.atcc.org |
| Take3 Micro-Volume Plate | BioTek | TAKE3 | Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA |
| Thermo Scientific FastDigest BamHI | ThermoFisher Scientific | FERFD0054 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific FastDigest DpnI | ThermoFisher Scientific | FERFD1704 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific FastDigest HindIII | ThermoFisher Scientific | FERFD0504 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific GeneJet Gel Extraction and DNA Cleanup Micro Kit | ThermoFisher Scientific | FERK0832 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific GeneJet Miniprep Kit | ThermoFisher Scientific | FERK0503 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F534L | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific T4 DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | FEREL0011 | Procure from any manufacturer |
| Thermocycler | Bio Rad | 1861096 | Procure from any manufacturer |
| UVP Visi-Blue Transilluminator | ThermoFisher Scientific | UV95043301 | Or other transiluminator that allows visualization of DNA |
| Water, Molecular Biology Grade | ThermoFisher Scientific | BP28191 | Procure from any manufacturer |
References
- Beuzón, C. R., Holden, D. W. Use of mixed infections with Salmonella strains to study virulence genes and their interactions in vivo. Microbes and Infection. 3 (14-15), 1345-1352 (2001).
- Bäumler, A. J., Tsolis, R. M., Valentine, P. J., Ficht, T. A., Heffron, F. Synergistic effect of mutations in invA and lpfC on the ability of Salmonella typhimurium to cause murine typhoid. Infection and Immunity. 65 (6), 2254-2259 (1997).
- Vital, M., Hammes, F., Egli, T. Competition of Escherichia coli O157 with a drinking water bacterial community at low nutrient concentrations. Water Research. 46 (19), 6279-6290 (2012).
- Schellenberg, J., Smoragiewicz, W., Karska-Wysocki, B. A rapid method combining immunofluorescence and flow cytometry for improved understanding of competitive interactions between lactic acid bacteria (LAB) and methicillin-resistant S. aureus (MRSA) in mixed culture. Journal of Microbiological Methods. 65 (1), 1-9 (2006).
- Becker, D., et al. Robust Salmonella metabolism limits possibilities for new antimicrobials. Nature. 440 (7082), 303 (2006).
- Rang, C., Galen, J. E., Kaper, J. B., Chao, L. Fitness cost of the green fluorescent protein in gastrointestinal bacteria. Canadian Journal of Microbiology. 49 (9), 531-537 (2003).
- Santiviago, C. A., et al. Analysis of pools of targeted Salmonella deletion mutants identifies novel genes affecting fitness during competitive infection in mice. PLoS Pathogens. 5 (7), e1000477 (2009).
- Ahmer, B. M., Gunn, J. S. Interaction of Salmonella spp. with the intestinal microbiota. Frontiers in Microbiology. 2, 101 (2011).
- Gallagher, L. A., Shendure, J., Manoil, C. Genome-scale identification of resistance functions in Pseudomonas aeruginosa using Tn-seq. MBio. 2 (1), (2011).
- Van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nature Methods. 6 (10), 767 (2009).
- van Opijnen, T., Lazinski, D. W., Camilli, A. Genome‐wide fitness and genetic interactions determined by Tn‐seq, a high‐throughput massively parallel sequencing method for microorganisms. Current Protocols in Microbiology. 36 (1), (2017).
- Mutalik, V. K., et al. Dual-barcoded shotgun expression library sequencing for high-throughput characterization of functional traits in bacteria. Nature Communications. 10 (1), 308 (2019).
- Yoon, H., Gros, P., Heffron, F. Quantitative PCR-based competitive index for high-throughput screening of Salmonella virulence factors. Infection and Immunity. 79 (1), 360-368 (2011).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6640-6645 (2000).
- Henard, C. A., Bourret, T. J., Song, M., Vázquez-Torres, A. Control of redox balance by the stringent response regulatory protein promotes antioxidant defenses of Salmonella. Journal of Biological Chemistry. 285 (47), 36785-36793 (2010).
- Poteete, A. R., Fenton, A. C. λ red-dependent growth and recombination of phage P22. Virology. 134 (1), 161-167 (1984).
- McCollister, B. D., Bourret, T. J., Gill, R., Jones-Carson, J., Vázquez-Torres, A. Repression of SPI2 transcription by nitric oxide-producing, IFNγ-activated macrophages promotes maturation of Salmonella phagosomes. Journal of Experimental Medicine. 202 (5), 625-635 (2005).
- Shaw, J. A., et al. Salmonella enterica serovar Typhimurium has three transketolase enzymes contributing to the pentose phosphate pathway. Journal of Biological Chemistry. 293 (29), 11271-11282 (2018).
- Freter, R., O’Brien, P., Macsai, M. S. Role of chemotaxis in the association of motile bacteria with intestinal mucosa: in vivo studies. Infection and immunity. 34 (1), 234-240 (1981).
- Taylor, R. K., Miller, V. L., Furlong, D. B., Mekalanos, J. J. Use of phoA gene fusions to identify a pilus colonization factor coordinately regulated with cholera toxin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (9), 2833-2837 (1987).
- Nogva, H. K., Dromtorp, S., Nissen, H., Rudi, K. Ethidium monoazide for DNA-based differentiation of viable and dead bacteria by 5′-nuclease PCR. Biotechniques. 34 (4), 804-813 (2003).
- Nocker, A., Camper, A. K. Novel approaches toward preferential detection of viable cells using nucleic acid amplification techniques. FEMS Microbiology Letters. 291 (2), 137-142 (2009).
- Nocker, A., Cheung, C. -. Y., Camper, A. K. Comparison of propidium monoazide with ethidium monoazide for differentiation of live vs. dead bacteria by selective removal of DNA from dead cells. Journal of Microbiological Methods. 67 (2), 310-320 (2006).
- Nocker, A., Mazza, A., Masson, L., Camper, A. K., Brousseau, R. Selective detection of live bacteria combining propidium monoazide sample treatment with microarray technology. Journal of Microbiological Methods. 76 (3), 253-261 (2009).
- Nocker, A., Sossa, K. E., Camper, A. K. Molecular monitoring of disinfection efficacy using propidium monoazide in combination with quantitative PCR. Journal of Microbiological Methods. 70 (2), 252-260 (2007).
- Nocker, A., Sossa-Fernandez, P., Burr, M. D., Camper, A. K. Use of propidium monoazide for live/dead distinction in microbial ecology. Applied and Environmental Microbiology. 73 (16), 5111-5117 (2007).
- Price-Carter, M., Tingey, J., Bobik, T. A., Roth, J. R. The Alternative Electron Acceptor Tetrathionate Supports B12-Dependent Anaerobic Growth ofSalmonella enterica Serovar Typhimurium on Ethanolamine or 1, 2-Propanediol. Journal of Bacteriology. 183 (8), 2463-2475 (2001).
- Taylor, R. G., Walker, D. C., McInnes, R. E. coli host strains significantly affect the quality of small scale plasmid DNA preparations used for sequencing. Nucleic Acids Research. 21 (7), 1677 (1993).
- Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. Gene disruption in Escherichia coli: Tc R and Km R cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene. 158 (1), 9-14 (1995).
