Indice competitivo digitale basato su PCR per l'analisi ad alto epossibilere del fitness nella Salmonella
Summary
Questo approccio molecolare per determinare la forma fisica batterica facilita il rilevamento preciso e preciso dei microrganismi utilizzando codici a barre specifici del DNA genomico quantificati tramite PCR digitale. Il protocollo descrive il calcolo dell’indice concorrenziale per i ceppi di Salmonella; tuttavia, la tecnologia è facilmente adattabile ai protocolli che richiedono la quantificazione assoluta di qualsiasi organismo geneticamente malleabile.
Abstract
Un indice competitivo è un metodo comune utilizzato per valutare la forma fisica batterica e/o la virulenza. L’utilità di questo approccio è esemplificata dalla sua facilità di esecuzione e dalla sua capacità di standardizzare la forma fisica di molti ceppi per un organismo di tipo selvaggio. La tecnica è limitata, tuttavia, dai marcatori fenotipici disponibili e dal numero di ceppi che possono essere valutati simultaneamente, creando la necessità di un gran numero di esperimenti di replica. In concomitanso con un gran numero di esperimenti, i costi di lavoro e materiali per quantificare i batteri basati su marcatori fenotipici non sono insignificanti. Per superare questi aspetti negativi pur mantenendo gli aspetti positivi, abbiamo sviluppato un approccio molecolare per quantificare direttamente i microrganismi dopo aver progettato marcatori genetici su cromosomi batterici. Unico, 25 coppia di base codici a barre DNA sono stati inseriti in un locus innocuo sul cromosoma di ceppi selvatici e mutanti di Salmonella. Gli esperimenti di competizione in vitro sono stati eseguiti utilizzando inocula costituiti da ceppi in pool. In seguito alla competizione, il numero assoluto di ogni ceppo è stato quantificato utilizzando la PCR digitale e gli indici competitivi per ogni ceppo sono stati calcolati in base a tali valori. I nostri dati indicano che questo approccio alla quantificazione della Salmonella è estremamente sensibile, preciso e preciso per rilevare sia i microrganismi altamente abbondanti (alta forma fisica) che rari (bassa forma fisica). Inoltre, questa tecnica è facilmente adattabile a quasi tutti gli organismi con cromosomi in grado di modificarsi, nonché a vari progetti sperimentali che richiedono la quantificazione assoluta dei microrganismi.
Introduction
Valutare la forma fisica e la virulenza degli organismi patogeni è un aspetto fondamentale della ricerca microbiologica. Consente di confrontare tra ceppi o tra organismi mutati, il che consente ai ricercatori di determinare l’importanza di determinati geni in condizioni specifiche. Tradizionalmente, la valutazione della virulenza utilizza un modello animale di infezione utilizzando diversi ceppi batterici e osservando l’esito dell’animale infetto (ad esempio Contagiosa50, Dose letale50, tempo a morte, gravità dei sintomi, mancanza di sintomi, ecc.). Questa procedura fornisce preziose descrizioni della virulenza, ma richiede che i ceppi causino notevoli differenze nei risultati al fine di rilevare variazioni da wild-type. Inoltre, i risultati sono semi-quantitativi perché mentre la progressione della malattia e la gravità dei sintomi possono essere soggettivamente quantificate nel tempo, l’interpretazione della virulenza rispetto al tipo selvaggio è più qualitativa (cioè più, meno o ugualmente virulenzia). Un’alternativa comune ai saggi di infettività degli animali per animali di esecuzione consiste nel generare indici competitivi (CI), valori che confrontano direttamente la forma fisica o la virulenza di un ceppo con una controparte di tipo selvatico in un’infezione mista1. Questa tecnica ha numerosi vantaggi rispetto a un modello animale tradizionale di infezione standardizzando la virulenza su un ceppo di tipo selvatico e determinando un valore quantificabile per riflettere il grado di attenuazione. Questa tecnica può anche essere adattata per analizzare le interazioni geniche nei batteri determinando un indice competitivo cancellato (COI)2. Il calcolo di un COI per un gruppo di organismi mutati consente ai ricercatori di determinare se due geni contribuiscono in modo indipendente alla patogenesi o se sono coinvolti nella stessa via di virulenza e dipendono l’uno dall’altro. Inoltre, il calcolo di una CI richiede l’enumerazione di batteri che possono fornire preziose informazioni sulla patogenesi degli organismi. Cite e COI consentono inoltre ai ricercatori di valutare ceppi avirulenti che non causano malattie cliniche ma hanno ancora differenze di forma fisica. Questa tecnica è limitata dall’uso di marcatori di resistenza agli antibiotici tradizionali per identificare i ceppi, limitando così il numero di ceppi di ingresso a uno o due alla volta. A causa di questa limitazione, è necessario un gran numero di gruppi sperimentali e repliche, che oltre ad aumentare i costi di manodopera e materiali, aumenta anche le opportunità di variabilità in condizioni sperimentali e risultati imprecisi. (Per un esame approfondito dei benefici e delle applicazioni dell’uso di infezioni miste per studiare la virulenza, la forma fisica e le interazioni geniche, vedere C.R. Beuzàn e D.W. Holden 1)
Si è cercato di superare questa limitazione, come l’uso di cellule fluorescenti quantificate tramite citometria di flusso3,4,5. Questa tecnica quantifica le cellule utilizzando 1) etichettate anticorpi contro i marcatori fenotipici o 2) prodotte endogenamente proteine fluorescenti. L’uso di anticorpi etichettati ha un limite di rilevamento di 1.000 cellule /mL, e quindi richiede un numero elevato di cellule per analizzare3. Le cellule che esprimono proteine fluorescenti hanno una fisiologia alterata e sono suscettibili ai cambiamenti di fitness derivanti dall’espressione ad alte proteine6. Entrambi i metodi sono limitati dal numero di marcatori fluorescenti rilevabili utilizzando la citometria di flusso. Un progresso nella quantificazione molecolare è stato raggiunto attraverso lo sviluppo di una tecnica di microarray che ha rilevato l’attenuazione in 120 ceppi da un’infezione mista iniziale di oltre 1.000 ceppi in un modello murino7. Questa tecnica ha utilizzato un’analisi microarray dell’RNA da ceppi mutati, che portano a una notevole variabilità nel risultato. Tuttavia, ha stabilito che grandi pool di infezioni miste possono essere uno strumento utile e che utilizzando tecniche di rilevamento sensibili, possono essere identificate differenze nella virulenza batterica. Con lo sviluppo del sequenziamento di nuova generazione, Tn-seq ha ampliato l’utilità delle mutazioni trasposoni, consentendo un potente metodo per quantificare i batteri che sono stati mutati casualmente8,9,10, 11. Recentemente è stato sviluppato un protocollo alternativo che elimina la necessità di trasposoni e utilizza invece i codici a barre del DNA per identificare e monitorare più facilmente i cambiamenti genomici e il loro impatto sulla forma fisica12. Questa tecnologia è un importante progresso, ma l’inserimento dei codici a barre genomici è ancora un processo casuale. Per superare la casualità degli esperimenti precedenti, Yoon e altri hanno sviluppato un metodo per calcolare i ceppi di Codi di Salmonella utilizzando codici a barre specifici del DNA inseriti in posizioni precise sui cromosomi dei batteri13. Sono stati rilevati ceppi in codice a barre unici utilizzando un metodo basato su qPCR con verde SYBR e primer specifici per ogni codice a barre univoco. La tecnica era limitata da vincoli imposti da qPCR, comprese le differenze nell’efficienza dei primer e dalla bassa sensibilità, evidenziate dalla necessità di pcR nidificati prima di qPCR. Tuttavia, questo approccio ha dimostrato che le modifiche genomiche mirate potrebbero essere sfruttate per rilevare e potenzialmente quantificare pool di ceppi batterici multipli.
Nel seguente protocollo, descriviamo una nuova metodologia per eseguire esperimenti di competizione batterica con grandi pool di inocua misti seguiti da una quantificazione accurata utilizzando una tecnica PCR digitale altamente sensibile. Il protocollo prevede ceppi batterici geneticamente etichettanti con un codice a barre DNA unico inserito su una regione innocua del cromosoma. Questa modifica consente di quantificare rapidamente e con precisione i ceppi utilizzando la moderna tecnologia molecolare invece delle tradizionali diluizioni seriali, la placcatura delle repliche e il conteggio delle unità formanti della colonia che si basano su marcatori fenotipici (cioè la resistenza agli antibiotici ). Le modifiche consentono la valutazione simultanea di molti ceppi in un unico inoculo raggruppato, riducendo sostanzialmente la possibilità di variabilità sperimentale perché tutti i ceppi sono esposti alle stesse condizioni esatte. Inoltre, mentre questa tecnica è stata sviluppata in Salmonella enterica sierovar Typhimurium, è altamente adattabile a qualsiasi organismo geneticamente malleabile e quasi qualsiasi progetto sperimentale in cui sono necessari conteggi batterici accurati, fornendo un nuovo strumento per aumentare la precisione e la produttività nei laboratori di microbiologia senza i vincoli imposti dai metodi precedenti.
Protocol
Representative Results
Discussion
La capacità di quantificare con precisione i microrganismi è di fondamentale importanza per la ricerca microbiologica e la capacità di enumerare ceppi unici provenienti da una popolazione mista iniziale si è dimostrata uno strumento inestimabile per valutare i tratti di forma e virulenza batteri. Tuttavia, le tecniche per realizzare questo non sono progredite al passo con gli sviluppi moderni nella biologia molecolare. La tecnologia per modificare facilmente i cromosomi di molti batteri, tra cui S. Typhimuri…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta dal George F. Haddix President’s Faculty Research Fund e dal National Institute of General Medical Science dei National Institutes of Health (NIH) con il numero di premio GM103427. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali dei National Institutes of Health.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22600028 | Procure from any manufacturer |
| 16 mL culture tubes | MidSci | 8599 | Procure from any manufacturer |
| 5-200 μL pipette tips | RAININ | 30389241 | Procure alternative tip brands with caution based on manufacturing quality |
| 5-50 μL multichannel pipette | RAININ | 17013804 | Use alternative multichannel pipettes with caution |
| Agarose | ThermoFisher Scientific | BP160-500 | Procure from any manufacturer |
| BLAST Analysis | NCBI | N/A | https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi |
| C1000 Touch Thermocycler with 96-Deep Well Reaction Module | Bio Rad | 1851197 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Chemically competent DH5α | Invitrogen | 18258012 | Procure from any manufacturer or prepare yourself |
| Chloramphenicol | ThermoFisher Scientific | BP904-100 | Procure from any manufacturer |
| Cytation5 Microplate reader | BioTek | CYT5MF | Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA |
| Data Analysis Software (QuantaSoft and QuantaSoft Data Analysis Pro) | Bio Rad | N/A | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio Rad | 12001925 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio Rad | 1863004 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Bio Rad | 1863024 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet Generator | Bio Rad | 1864008 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet Generator | Bio Rad | 1863009 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Droplet Generation Oil for Probes | Bio Rad | 1863005 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Kanamycin | ThermoFisher Scientific | BP906-5 | Procure from any manufacturer |
| Luria-Bertani agar | ThermoFisher Scientific | BP1425-2 | Procure from any manufacturer or make it yourself from agar, tryptone, yeast digest, and NaCl |
| Luria-Bertani broth | ThermoFisher Scientific | BP1426-2 | Procure from any manufacturer or make it yourself from tryptone, yeast digest, and NaCl |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio Rad | 1814040 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| PCR Tubes | Eppendorf | 951010022 | Procure from any manufacturer |
| Petri dishes | ThermoFisher Scientific | FB0875712 | Procure from any manufacturer |
| pPCR Script Cam SK+ | Stratagene/Agilent | 211192 | No longer available commercially |
| Primer/Probe Design | IDT | N/A | https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index |
| pSKAP and pSKAP_Barcodes | Addgene | Plasmid numbers 122702-122726 | www.addgene.org |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio Rad | 1814000 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| QX200 Droplet Generator | Bio Rad | 1864002 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| QX200 Droplet Reader | Bio Rad | 1864003 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| S. Typhimurium strain ATCC 14028s | ATCC | ATCC 14028s | www.atcc.org |
| Take3 Micro-Volume Plate | BioTek | TAKE3 | Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA |
| Thermo Scientific FastDigest BamHI | ThermoFisher Scientific | FERFD0054 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific FastDigest DpnI | ThermoFisher Scientific | FERFD1704 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific FastDigest HindIII | ThermoFisher Scientific | FERFD0504 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific GeneJet Gel Extraction and DNA Cleanup Micro Kit | ThermoFisher Scientific | FERK0832 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific GeneJet Miniprep Kit | ThermoFisher Scientific | FERK0503 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F534L | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific T4 DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | FEREL0011 | Procure from any manufacturer |
| Thermocycler | Bio Rad | 1861096 | Procure from any manufacturer |
| UVP Visi-Blue Transilluminator | ThermoFisher Scientific | UV95043301 | Or other transiluminator that allows visualization of DNA |
| Water, Molecular Biology Grade | ThermoFisher Scientific | BP28191 | Procure from any manufacturer |
References
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