규제 RNA 결합 단백질에 대한 결합 부위를 식별하기 위한 서열 공간 탐색
Summary
서열 특이성은 유전자 조절에 매우 중요합니다. 특정 서열을 인식하는 조절 단백질은 유전자 조절에 중요합니다. 이러한 단백질에 대한 기능적 결합 부위를 정의하는 것은 어려운 생물학적 문제입니다. RNA 결합 단백질에 대한 결합 부위의 식별을 위한 반복적 접근법은 여기에 기재되어 있으며 모든 RNA 결합 단백질에 적용가능하다.
Abstract
유전자 조절은 모든 세포에서 중요한 역할을 합니다. 전사, 전사 후 (또는 RNA 처리), 번역 및 번역 후 단계는 특정 유전자를 조절하는 데 사용됩니다. 서열 특이적 핵산 결합 단백질은 공간적 또는 시간적 유전자 발현을 조절하기 위해 특정 서열을 표적으로 한다. 핵산의 결합 부위는 전형적으로 돌연변이 분석을 특징으로 한다. 그러나, 관심있는 수많은 단백질은 그러한 특성화에 대한 알려진 결합 부위가 없다. 여기에서 우리는 RNA 결합 단백질을 위한 이전에 알려지지 않은 결합 사이트를 확인하기 위하여 접근을 기술합니다. 그것은 무작위 시퀀스 풀로 시작하는 시퀀스의 반복적 선택 및 증폭을 포함한다. 이러한 단계-전사, 결합 및 증폭의 여러 라운드에 이어 농축된 서열은 바람직한 결합 부위를 식별하기 위해 서열화된다. 이 접근법의 성공은 시험관 내 결합 성 결합 방법을 사용하여 모니터링됩니다. 이어서, 생체외 및 생체내 기능성 시험은 선택된 서열의 생물학적 관련성을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 이 접근법은 단백질 결합 및 언바운드 RNA를 분리하는 분석이 존재하는 임의의 RNA 결합 단백질에 대해 이전에 알려지지 않은 결합 부위의 식별 및 특성화를 허용한다.
Introduction
세포 생물학에서, 유전자 조절은 중앙 역할을 합니다. 유전자 발현 경로를 따라 하나 또는 여러 단계에서, 유전자는 조절될 가능성이 있다. 이러한 단계에는 전사(개시, 신장 및 종결)뿐만 아니라 접합, 폴리아데닐화 또는 3′ 말단 형성, RNA 수출, mRNA 번역 및 1차 전사체의 붕괴/국소화가 포함됩니다. 이 단계에서, 핵산 결합 단백질은 유전자 조절을 조절한다. 이러한 단백질에 대한 결합 부위의 식별은 유전자 조절을 연구하는 중요한 측면이다. 돌연변이 분석 및 계통유전학 적 서열 비교는 프로모터, 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 요소 및 번역 신호와 같은 핵산에서 조절 서열 또는 단백질 결합 부위를 발견하기 위해 사용되어 왔다1. 2개 , 3개 , 4.
사전 mRNA 접합은 유전자 발현 및 조절 동안 필수적인 단계이다. 포유류 유전자의 대다수는, 인간에 있는 사람들을 포함하여, 인트론이 있습니다. 이 전사체의 큰 분획은 대안적으로 접합되고, 동일한 유전자 또는 1차 전사체로부터 다중 mRNA 및 단백질 이소폼을 생성한다. 이 이소양식에는 세포 생물학에 있는 세포 특정 그리고 발달 역할이 있습니다. 5′ 스플라이스 사이트, 분기점 및 폴리피리미딘-요로/3′ 접합 사이트는 규제대상인 중요한 접합 신호입니다. 부정적인 규제에서, 그렇지 않으면 강한 스플라이스 사이트는 억압되는 반면, 긍정적 인 규제에서 그렇지 않으면 약한 스플라이스 사이트가 활성화됩니다. 이러한 이벤트의 조합은 기능적으로 구별되는 등소폼의 과다를 생성합니다. RNA 결합 단백질은 이 대체 접합 사건에서 중요한 역할을 합니다.
수많은 단백질은 그의 결합 부위 또는 RNA 표적이5,6으로식별되는 것으로 알려져 있다. 그들의 다운스트림 생물학 표적 또는 서열에 규정한 단백질을 연결하는 것은 수시로 복잡한 프로세스입니다. 이러한 단백질의 경우, 그들의 표적 RNA 또는 결합 부위의 식별은 그들의 생물학적 기능을 정의하는 데 중요한 단계이다. 결합 부위가 확인되면 표준 분자 및 생화학 분석을 사용하여 더욱 특성화 될 수 있습니다.
여기에 설명된 접근 방식에는 두 가지 장점이 있습니다. 먼저, 관심 있는 단백질에 대해 이전에 알려지지 않은 결합 부위를 식별할 수 있다. 둘째, 이 접근법의 추가적인 장점은 동시에 채도 돌연변이 발생을 허용한다는 것입니다. 따라서 RNA에서 단백질 결합 부위를 식별하는 더 빠르고, 쉽고, 비용이 적게 드는 도구를 제공합니다. 원래, 이러한 접근법(SelEX 또는 EXponential 농축에 의한 리간드의 체계적인 진화)은 자체 mRNA에서 리보솜 결합 부위와 겹치는 박테리오파지 T4 DNA 폴리머라제(gene 43 단백질)에 대한 결합 부위를 특성화하는 데 사용되었다. 바인딩 사이트에는 분석7에대한 65,536 개의 무작위 변형을 나타내는 8 base 루프 시퀀스가 포함되어 있습니다. 둘째, 상기 접근법은 또한 상이한 염료에 대한 특정 결합 부위 또는 압타머가 약 1013 서열 8의 풀로부터 선택될 수 있음을 보여주기 위해 독립적으로 사용되었다. 실제로, 이러한 접근법은 단백질, 소분자 및 세포와 같은 수많은 리간드를 결합하기 위한 aptamers(RNA 또는 DNA 서열)를 식별하고, 촉매9를위해 많은 상이한 문맥에서 광범위하게 사용되어 왔다. 일례로, 압타머는 카페인10에서하나의 메틸 그룹의 존재에 의해 다른 두 크산틴 유도체, 카페인 및 테오필린 을 구별 할 수 있습니다. 우리는 RNA 결합 단백질이 접합 또는 접합 조절11에서어떻게 작동하는지 연구하기 위해이 접근법 (SELEX 또는 반복 선택 증폭)을 광범위하게 사용했으며, 이는 아래 논의의 기초가 될 것입니다.
무작위 라이브러리: 우리는 31개의 뉴클레오티드의 무작위 라이브러리를 사용했습니다. 랜덤 라이브러리에 대한 길이 고려는 일반적인 접합 계수 U2AF65가 분기 점 서열과 3′ 스플라이스 사이트 사이의 서열에 결합한다는 생각에 느슨하게 기초했다. 평균적으로, 메타조안에서 이러한 접합 신호 사이의 간격은 20~40개의 뉴클레오티드 의 범위에 있다. 또 다른 단백질성-치사성은 표적 프리-mRNA, 변압기의3′ 스플라이스 부위 근처의 불쌍한 특징조절 서열에 결합하는 것으로 알려졌다. 따라서, 우리는 시험관 내 전사에 대한 T7 RNA 폴리머라제 프로모터의 PCR 증폭 및 부착을 허용하도록 제한 효소 부위를 가진 프라이머 결합 부위에 의해 측면에 있는 31개의 뉴클레오티드의 무작위 영역을 선택했다. 이론적 라이브러리 크기 또는 복잡성은 431 또는 약 1018이었다. 우리는 아래에 설명된 실험을 위해 무작위 RNA 풀(~10 12-1015)을준비하기 위해 이 라이브러리의 작은 부분을 사용했습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
핵산 결합 단백질은 동물 및 식물 개발의 중요한 조절자입니다. SELEX 절차에 대한 주요 요구 사항은 단백질 결합 및 언바운드 RNA 분획을 분리하는 데 사용할 수 있는 분석법의 개발입니다. 원칙적으로, 이러한 분석법은 재조합 단백질, 정제 단백질, 또는 단백질 복합체에 대한 필터 결합 분석, 겔 이동성 이동 분석, 또는 매트릭스 결합 분석기(19)와 같은 시험관내 결합 분석기일 수…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 과거 자금조달을 위한 건강의 국가 학회를 감사합니다.
Materials
| Gel Electrophoresis equipment | Standard | Standard | |
| Glass Plates | Standard | Standard | |
| Nitrocellulose | Millipore | HAWP | |
| Nitrocellulose | Schleicher & Schuell | PROTRAN | |
| polyacrylamide gel solutions | Standard | Standard | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| Recombinant PTB | Laboratory Preparation | Not applicable | |
| Reverse Transcriptase | NEB | M0277S | |
| Vacuum manifold | Fisher Scientific | XX1002500 | Millipore 25mm Glass Microanalysis Vacuum Filter |
| Vacuum manifold | Millipore | XX2702552 | 1225 Sampling Vacuum Manifold |
| X-ray films | Standard | Standard |
References
- Pribnow, D. Nucleotide sequence of an RNA polymerase binding site at an early T7 promoter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (3), 784-788 (1975).
- Breathnach, R., Chambon, P. Organization and expression of eucaryotic split genes coding for proteins. Annual Review of Biochemistry. 50, 349-383 (1981).
- Wickens, M., Stephenson, P. Role of the conserved AAUAAA sequence: four AAUAAA point mutants prevent messenger RNA 3′ end formation. Science. 226 (4678), 1045-1051 (1984).
- Kozak, M. An analysis of 5′-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs. Nucleic Acids Research. 15 (20), 8125-8148 (1987).
- Ray, D., Ha, K. C. H., Nie, K., Zheng, H., Hughes, T. R., Morris, Q. D. RNAcompete methodology and application to determine sequence preferences of unconventional RNA-binding proteins. Methods. 118, 3-15 (2017).
- Jolma, A., et al. Multiplexed massively parallel SELEX for characterization of human transcription factor binding specificities. Genome Research. 20 (6), 861-873 (2010).
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
- Cowperthwaite, M. C., Ellington, A. D. Bioinformatic analysis of the contribution of primer sequences to aptamer structures. Journal of Molecular Evolution. 67 (1), 95-102 (2008).
- Jenison, R. D., Gill, S. C., Pardi, A., Polisky, B. High-resolution molecular discrimination by RNA. Science. 263 (5152), 1425-1429 (1994).
- Singh, R., Valcarcel, J., Green, M. R. Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins. Science. 268 (5214), 1173-1176 (1995).
- Milligan, J. F., Uhlenbeck, O. C. Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase. Methods in Enzymology. 180, 51-62 (1989).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular Cloning. , (1989).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Robida, M., Sridharan, V., Morgan, S., Rao, T., Singh, R. Drosophila polypyrimidine tract-binding protein is necessary for spermatid individualization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2010).
- Banerjee, H., Rahn, A., Gawande, B., Guth, S., Valcarcel, J., Singh, R. The conserved RNA recognition motif 3 of U2 snRNA auxiliary factor (U2AF(65)) is essential in vivo but dispensable for activity in vitro. RNA. 10 (65), 240-253 (2004).
- Gorlach, M., Burd, C. G., Dreyfuss, G. The determinants of RNA-binding specificity of the heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C proteins. J Biol Chem. 269 (37), 23074-23078 (1994).
- Valcarcel, J., Singh, R., Zamore, P. D., Green, M. R. The protein Sex-lethal antagonizes the splicing factor U2AF to regulate alternative splicing of transformer pre-mRNA. Nature. 362 (6416), 171-175 (1993).
- Wilson, C., Szostak, J. W. Isolation of a fluorophore-specific DNA aptamer with weak redox activity. Chemistry & Biology. 5 (11), 609-617 (1998).
- Joyce, G. F. Reflections of a Darwinian Engineer. Journal of Molecular Evolution. 81 (5-6), 146-149 (2015).
- McKeague, M., Derosa, M. C. Challenges and opportunities for small molecule aptamer development. Journal of Nucleic Acids. 2012, 748913 (2012).
- Lambert, N., Robertson, A., Jangi, M., McGeary, S., Sharp, P. A., Burge, C. B. RNA Bind-n-Seq: quantitative assessment of the sequence and structural binding specificity of RNA binding proteins. Molecular Cell. 54 (5), 887-900 (2014).
- Szeto, K., et al. RAPID-SELEX for RNA aptamers. PLoS One. 8 (12), e82667 (2013).
- Rohloff, J. C., et al. Nucleic Acid Ligands With Protein-like Side Chains: Modified Aptamers and Their Use as Diagnostic and Therapeutic Agents. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 3, e201 (2014).
- Gold, L., et al. Aptamer-based multiplexed proteomic technology for biomarker discovery. PLoS One. 5 (12), e15004 (2010).
- Zhuo, Z., et al. Recent Advances in SELEX Technology and Aptamer Applications in Biomedicine. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), (2017).
- Blind, M., Blank, M. Aptamer Selection Technology and Recent Advances. Molecular Therapy. Nucleic Acids. 4, e223 (2015).
- Jijakli, K., et al. The in vitro selection world. Methods. 106, 3-13 (2016).
