जैवबहुलक Additives की उपस्थिति में कैल्शियम कार्बोनेट गठन
Summary
हम कैल्शियम कार्बोनेट क्रिस्टल की वर्षा और लक्षणीकरण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो जैवबहुलकों की उपस्थिति में बनते हैं।
Abstract
जैव-खनिजीकरण कार्बनिक अणुओं की उपस्थिति में खनिजों का निर्माण होता है, जो प्रायः सजीवों में कार्यात्मक और/अथवा संरचनात्मक भूमिकाओं से संबंधित होता है। यह एक जटिल प्रक्रिया है और इसलिए एक सरल, इन विट्रो में, जैव खनिजीकरण प्रक्रिया पर पृथक अणुओं के प्रभाव को समझने के लिए प्रणाली की आवश्यकता होती है। कई मामलों में, जैवखनिजीकरण को कोशिकीय मैट्रिक्स में जैवबहुलकों द्वारा निर्देशित किया जाता है। इन विट्रो में कैल्साइट की आकृति विज्ञान और संरचना पर पृथक जैवबहुलकों के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए, हमने कैल्शियम कार्बोनेट की वर्षा के लिए वाष्प विसरण विधि का उपयोग किया है, विशेषता के लिए इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और माइक्रो रमन को स्कैन किया है, और क्रिस्टल में एक biopolymer की मात्रा को मापने के लिए पराबैंगनी-दृश्य (यूवी/ इस विधि में, हम पृथक जैवबहुलकों को उजागर करते हैं, जो कैल्शियम क्लोराइड विलयन में घुलजादे होते हैं, जो ठोस अमोनियम कार्बोनेट के अपघटन से उत्पन्न होने वाली गैसीय अमोनिया और कार्बन डाइऑक्साइड को प्रकट करते हैं। उन परिस्थितियों के तहत जहां कैल्शियम कार्बोनेट के घुलनशील उत्पाद तक पहुँच जाता है, कैल्शियम कार्बोनेट वेग और क्रिस्टल बनते हैं। कैल्शियम कार्बोनेट में विभिन्न बहुरूप होते हैं जो उनकी ऊष्मागतिक स्थिरता में भिन्न होते हैं: अक्रिस्टलीय कैल्शियम कार्बोनेट, वैराइट, अरगोनाइट, और कैल्साइट। जैवबहुलकों की अनुपस्थिति में, स्वच्छ परिस्थितियों में कैल्शियम कार्बोनेट अधिकतर कैल्साइट रूप में होता है, जो कैल्शियम कार्बोनेट का सबसे ऊष्मागतिक रूप से स्थिर बहुरूप है। इस विधि की आकृति विज्ञान और कैल्शियम कार्बोनेट क्रिस्टल की संरचना पर biopolymeric additives के प्रभाव की जांच. यहाँ, हम कैल्शियम कार्बोनेट क्रिस्टल के गठन पर एक extracellular जीवाणु प्रोटीन, TapA, के अध्ययन के माध्यम से प्रोटोकॉल का प्रदर्शन. विशेष रूप से, हम प्रयोगात्मक सेट अप पर ध्यान केंद्रित, और विशेषता तरीकों, जैसे ऑप्टिकल और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के रूप में के रूप में अच्छी तरह से रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी.
Introduction
जैव-खनिजीकरण कार्बनिक अणुओं की उपस्थिति में खनिजों का निर्माण होता है, जो प्रायः सजीवों में कार्यात्मक और/अथवा संरचनात्मक भूमिकाओं से संबंधित होता है। जैव-खनिजीकरण इंट्रासेल्यूलर हो सकता है, जैसे मैग्नेटोटेक्टिक बैक्टीरिया1, या एक्स्ट्रासेल्यूलर के अंदर मैग्नेटाइट के गठन में, जैसा कि समुद्र में कैल्शियम कार्बोनेट के गठन में2,हाइड्रॉक्सीपैटाइट का जो में कोलेजन से संबंधित है हड्डियों3 और तामचीनी कि दांतों में एमेलोजेनिन के साथ जुड़ा हुआ है4. जैव-खनिजीकरण एक जटिल प्रक्रिया है जो जीव में कई मापदंडों पर निर्भर करती है। इसलिए, अध्ययन के तहत प्रणाली को सरल बनाने के लिए, प्रक्रिया पर अलग-अलग घटकों के प्रभाव का मूल्यांकन करना आवश्यक है। कई मामलों में, जैव खनिजीकरण कोशिकाबाह्य जैवबहुलकों की उपस्थिति से प्रेरित होता है। यहाँ प्रस्तुत विधि का उद्देश्य इस प्रकार है: (1) एक वाष्प प्रसार विधि का उपयोग करते हुए, इन विट्रो में पृथक जैवबहुलकों की उपस्थिति में कैल्शियम कार्बोनेट क्रिस्टल का निर्माण करना। (2) कैल्शियम कार्बोनेट की आकृति विज्ञान और संरचना पर जैवबहुलकों के प्रभाव का अध्ययन करना।
कार्बनिक एडिटिव्स की उपस्थिति में इन विट्रो में कैल्शियम कार्बोनेट को वेग देने के तीन प्रमुख तरीकों का उपयोग किया जाता है5,6. पहली विधि, जिसे हम समाधान विधि के रूप में संदर्भित करेंगे, कैल्शियम का घुलनशील नमक (जैसे, CaCl2)कार्बोनेट के घुलनशील नमक (जैसे, सोडियम कार्बोनेट) के साथ मिश्रण पर आधारित है। मिश्रण प्रक्रिया कई तरीकों से की जा सकती है: एक रिएक्टर के अंदर तीन कोशिकाओं के साथ जो छिद्रयुक्त झिल्ली7से अलग होते हैं । यहाँ, बाहरी कोशिकाओं में से प्रत्येक में घुलनशील नमक होता है और केंद्रीय कोशिका में परीक्षण किए जाने वाले योज्य के साथ एक समाधान होता है। कैल्शियम और कार्बोनेट फैलाना बाहरी से मध्य कोशिका तक फैलाना, जिसके परिणामस्वरूप कम घुलनशील कैल्शियम कार्बोनेट की वर्षा होती है जब कैल्शियम और कार्बोनेट की सांद्रता उनके विलेयता उत्पाद से अधिक होती है, केएसपी [Ca2+]CO3 2-$. एक अतिरिक्त मिश्रण विधि डबल जेट प्रक्रिया8है. इस विधि में, प्रत्येक घुलनशील नमक एक अलग सिरिंज से एक हलचल समाधान योज्य युक्त करने के लिए इंजेक्शन है, जहां कैल्शियम कार्बोनेट वेग. यहाँ, इंजेक्शन और इसलिए मिश्रण दर अच्छी तरह से नियंत्रित किया जाता है, पिछले विधि जहां मिश्रण प्रसार द्वारा नियंत्रित किया जाता है के साथ इसके विपरीत.
CaCO3 को क्रिस्टलीकृत करने के लिए उपयोग की जाने वाली दूसरी विधि Kitano विधि9है। यह विधि कार्बोनेट/हाइड्रोजन कार्बोनेट संतुलन (2HCO3– (अ) + Ca2+(अ) 
CaCO 3(s) + CO 2(g) + H2O (l)पर आधारित है। यहाँ, ब्व्2 एक ठोस रूप में CaCO3 युक्त समाधान में bubbled है, बाईं ओर संतुलन स्थानांतरण और इसलिए कैल्शियम कार्बोनेट भंग. अविलेय कैल्शियम कार्बोनेट फ़िल्टर किया जाता है और वांछित additives को बाइकार्बोनेट-रिच समाधान में जोड़ा जाता है। सीओ2 तो वाष्पित करने के लिए अनुमति दी है, जिससे दाईं ओर प्रतिक्रिया स्थानांतरण, additives की उपस्थिति में कैल्शियम कार्बोनेट बनाने.
कैल्शियम कार्बोनेट क्रिस्टलीकरण की तीसरी विधि, जिसका हम यहां वर्णन करेंगे, वाष्प विसरण विधि10है। इस सेट-अप में, कैल्शियम क्लोराइड के विलयन में घुली हुई कार्बनिक योज्य को अमोनियम कार्बोनेट के पास एक बंद कक्ष में पाउडर के रूप में रखा जाता है। जब अमोनियम कार्बोनेट पाउडर कार्बन डाइऑक्साइड और अमोनिया में विघटित हो जाता है, तो वे कैल्शियम आयनों वाले समाधान (उदाहरण के लिए, CaCl2) और कैल्शियम कार्बोनेट वेगित हो जाता है (चित्र 1 उदाहरण के लिए देखें)। कैल्शियम कार्बोनेट क्रिस्टल धीमी वर्षा या तेजी से वर्षा से विकसित कर सकते हैं। धीमी वर्षा के लिए, CaCl2 समाधान में योज्य युक्त एक समाधान अमोनियम कार्बोनेट पाउडर के बगल में एक desiccator में रखा गया है। प्रोटोकॉल में लंबाई में वर्णित तीव्र वर्षा में, योज्य विलयन और अमोनियम कार्बोनेट दोनों को एक बहु-वेल प्लेट में एक साथ करीब रखा जाता है। धीमी गति से वर्षा विधि कम नाभिक केन्द्रों और बड़ा क्रिस्टल का उत्पादन होगा, और तेजी से वर्षा अधिक नाभिक केन्द्रों और छोटे क्रिस्टल में परिणाम होगा.
ऊपर वर्णित विधियों उनकी तकनीकी जटिलता में, नियंत्रण के स्तर में और वर्षा की प्रक्रिया की दर में अलग हैं. मिश्रण विधि डबल जेट और तीन सेल प्रणाली दोनों के लिए एक विशेष सेट अप6 की आवश्यकता है। मिश्रण विधि में, अन्य घुलनशील प्रतिआयनों (उदा., ना+, सीएल–)6 की उपस्थिति अपरिहार्य है, जबकि कितानो विधि में कैल्शियम और (बी) कार्बोनेट समाधान में केवल आयन हैं और इसमें अतिरिक्त की उपस्थिति शामिल नहीं है प्रति आयनों (उदा., ना+, सीएल–)। इसके अलावा, मिश्रण विधि अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा की आवश्यकता है और इसलिए यह महंगा biopolymers के साथ काम करने के लिए उपयुक्त नहीं है. डबल जेट का लाभ यह है कि यह समाधान इंजेक्शन की दर को नियंत्रित करने के लिए संभव है और यह अन्य तरीकों की तुलना में एक तेजी से प्रक्रिया है.
Kitano विधि और वाष्प प्रसार विधि का लाभ यह है कि कैल्शियम कार्बोनेट के गठन में सीओ2 के प्रसार द्वारा नियंत्रित किया जाता है / बाहर एक CaCl2 समाधान, इस प्रकार धीमी नाभिकन और वर्षा प्रक्रियाओं की जांच करने के लिए अनुमति देता है 11 , 12इसके अतिरिक्त , ब् व्2 के विसरण द्वारा कैल्शियम कार्बोनेट का निर्माण विवो13,14,15में कैल्केंसेशन प्रक्रियाओं के समान हो सकता है . इस विधि में, अच्छी तरह से परिभाषित और अलग क्रिस्टल16का गठन कर रहे हैं. पिछले, कैल्शियम कार्बोनेट गठन पर एक या कई biopolymers के प्रभाव का परीक्षण किया जा सकता है. यह कैल्शियम कार्बोनेट गठन पर योज्य सांद्रता की एक श्रृंखला के प्रभाव के साथ-साथ biopolymers के मिश्रण का अध्ययन करने में सक्षम बनाता है – सभी एक नियंत्रित तरीके से प्रदर्शन किया। इस विधि सांद्रता और additives की मात्रा की एक बड़ी रेंज के साथ उपयोग के लिए उपयुक्त है. उपयोग की गई न्यूनतम मात्रा लगभग 50 डिग्री सेल्सियस है और इसलिए यह विधि लाभप्रद है जब उपलब्ध जैवबहुलकों की सीमित मात्रा होती है। अधिकसेअधिक मात्रा एक बड़ा अच्छी तरह से प्लेट की पहुंच पर निर्भर करता है, या desiccator जिसमें प्लेट या CaCl2 युक्त बीकर डाला जा रहे हैं. नीचे वर्णित विधि को 96-वेल प्लेट में काम करने के लिए अनुकूलित किया गया है जिसमें एक बायोबहुलक को प्रोटीन टैपा17चुना गया है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ वर्णित विधि कार्बनिक additives की उपस्थिति में कैल्शियम कार्बोनेट क्रिस्टल बनाने और आकृति विज्ञान और इन विट्रो में कैल्शियम कार्बोनेट क्रिस्टल की संरचना पर कार्बनिक biopolymers के प्रभाव का मूल्यांकन करने …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक ों यथावकेत प्रो लिया अदी, प्रो जोनाथन इरेज़ और डॉ. इस शोध इजरायल विज्ञान फाउंडेशन (ISF), अनुदान 1150/
Materials
| Acetic acid | Gadot | 64-19-7 | |
| Ammonium carbonate | Sigma-Aldrich | 506-87-6 | |
| Calcium chloride dihydrate | Merck KGaA | 10035-04-8 | |
| Ethanol Absolute | Gadot | 64-17-5 | |
| Micro-Raman | Renishaw | inVia Reflex spectrometer coupled with an upright Leica optical microscope | |
| Microscope | Nikon | Eclipse 90i model | |
| Nis elements Br software | Nikon | For microscope imaging | |
| Scanning Electron Microscope | ThermoFisher Scientific | FEI Sirion microscope | |
| Spectrophotometer | JASCO | V-670 model | |
| Sputter coater | Polaron | SC7640 model |
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