생체 고분자 첨가제의 존재에 있는 탄산칼슘 대형
Summary
우리는 생체 고분자의 존재에서 형성되는 탄산 칼슘 결정의 침전 및 특성화를위한 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
생물 미네랄화는 유기 분자가있는 미네랄의 형성으로, 종종 살아있는 유기체의 기능 적 및 / 또는 구조적 역할과 관련이 있습니다. 그것은 복잡한 과정이므로 간단한, 시험관 내에서, 시스템은 생물 미네랄화 과정에 대한 분리 된 분자의 효과를 이해하는 데 필요합니다. 많은 경우에, 생물 미네랄화는 세포외 매트릭스에 있는 바이오 폴리머에 의해 지시됩니다. 체외에서 방해석의 형태 및 구조에 대한 분리된 생체 고분자의 효과를 평가하기 위해, 우리는 탄산칼슘의 침전을 위한 증기 확산 방법, 특성화를 위한 주사 전자 현미경 및 마이크로 라만, 결정내 바이오폴리머의 양을 측정하기 위한 자외선(UV/Vis) 흡광도. 이 방법에서, 우리는 고체 암모늄 탄산염의 분해에서 유래 기체 암모니아 및 이산화탄소에, 염화 칼슘 용액에 용해 된 고립 된 바이오 폴리머를 노출. 탄산 칼슘의 용해도 생성물이 도달하는 조건에서 탄산 칼슘침전액과 결정이 형성됩니다. 탄산 칼슘은 열역학적 안정성이 다른 다른 다형성을 가지고 있습니다: 비정질 탄산칼슘, 바테라이트, 아라고나이트 및 방해석. 바이오 폴리머가없는 경우, 깨끗한 조건에서 탄산 칼슘은 주로 카보네이트 칼슘의 가장 열역학적으로 안정적인 다형성인 방해석 형태로 존재합니다. 이 방법은 탄산 칼슘 결정의 형태 및 구조에 대한 생체 고분자 첨가제의 영향을 검사합니다. 여기에서, 우리는 칼슘 탄산염 결정의 대형에 세포외 세균성 단백질, TapA의 연구 결과, 프로토콜을 보여줍니다. 특히, 우리는 광학 및 전자 현미경 검사법뿐만 아니라 라만 분광법과 같은 실험 설정 및 특성화 방법에 중점을 둡니다.
Introduction
생물 미네랄화는 유기 분자가있는 미네랄의 형성으로, 종종 살아있는 유기체의 기능 적 및 / 또는 구조적 역할과 관련이 있습니다. 생체 미네랄화는 성게에서 탄산칼슘의 형성과 같이 자성 균1,또는 세포 외의 자석 형성과 같이 세포내일 수 있으며, 콜라겐과 관련된 하이드록시아파티트2 뼈3 치아에 아멜로제닌과 관련된 에나멜의4. 생물 미네랄화는 살아있는 유기체의 많은 매개 변수에 의존하는 복잡한 과정입니다. 따라서, 연구 하에 시스템을 단순화하기 위해서는, 공정에 별도의 구성 요소의 효과를 평가할 필요가있다. 많은 경우에, 생물 미네랄화는 세포 외 생체 고분자의 존재에 의해 유도됩니다. 여기에 제시된 방법의 목적은 다음과 같다: (1) 체외에서 분리된 생체 고분자의 존재 내에서 탄산칼슘 결정을 형성하기 위해, 증기 확산 방법을 사용한다. (2) 탄산 칼슘의 형태와 구조에 대한 생체 고분자의 영향을 연구한다.
유기 첨가제의 존재에서 시험관 내에서 탄산 칼슘을 침전하는 세 가지주요 방법은 5,6을사용한다. 우리가 용액 방법으로 지칭할 첫 번째 방법은 칼슘의 수용성 염 (예를 들어, CaCl2)을 탄산염 (예 : 탄산나트륨)의 수용성 염과 혼합하는 것을 기반으로합니다. 상기 혼합 공정은 여러 가지 방법으로 수행될 수 있다: 다공성 멤브레인7에의해 분리되는 3개의 세포를 가진 반응기 내부. 여기서, 각각의 외부 세포는 수용성 염을 함유하고 중앙 세포는 시험할 첨가제를 함유하는 용액을 함유한다. 칼슘과 탄산염이 외부에서 중간 세포로 확산되어, 칼슘과 탄산염의 농도가 용해도 제품을 초과할 때, Ksp = [Ca 2+][CO3]의 침전을 초래합니다. 2-[. 추가 혼합 방법은 이중 제트 절차8입니다. 이 방법에서, 각각의 가용성 염은 탄산칼슘이 침전되는 첨가제를 함유하는 교반 용액에 별도의 주사기로부터 주입된다. 여기서, 주입 및 따라서 혼합 속도는 혼합이 확산에 의해 제어되는 이전 방법과 대조적으로 잘 제어된다.
CaCO 3을 결정화하는 데 사용되는 두 번째 방법은 기타노 방법 9입니다. 이 방법은 탄산수소/탄산수소 평형(2HCO3- (aq) + Ca2+(aq) 
CaCO3 (들) + CO2(g) + H2(l))를 기초로 한다. 여기서, CO2는 CaCO3를 함유하는 용액내로 고체 형태로 버블링되어, 평형을 왼쪽으로 이동시키고 따라서 탄산칼슘을 용해시한다. 용해되지 않은 탄산칼슘을 여과하고 원하는 첨가제를 중탄산염이 풍부한 용액에 첨가합니다. CO2는 증발할 수 있게 되고, 이에 의해 반응을 오른쪽으로 이동시키고, 첨가제의 존재 속에서 탄산칼슘을 형성한다.
여기서 설명할 탄산칼슘 결정화의 세 번째 방법은 증기 확산 방법10입니다. 이 설정에서, 염화 칼슘용액에 용해된 유기 첨가제는 카보네이트 암모늄 근처의 밀폐된 챔버에 분말 형태로 배치된다. 카보늄 탄산암모늄 분말이 이산화탄소 및 암모니아로 분해되면 칼슘 이온(예: CaCl2)을함유하는 용액으로 확산되고 탄산칼슘이 침전됩니다(그림 1 참조). 탄산 칼슘 결정은 느린 강수 또는 빠른 강수량에 의해 성장할 수 있습니다. 느린 침전을 위해, CaCl2 용액에 첨가제를 함유하는 용액은 카보네이트 암모늄 분말 옆에 있는 건조제에 놓입니다. 프로토콜의 길이로 설명된 빠른 침전에서 첨가제 용액과 탄산암모늄은 모두 다중 웰 플레이트에 더 가깝게 배치됩니다. 느린 침전 방법은 더 적은 핵 센터와 더 큰 결정을 생성하고, 빠른 강수량은 더 많은 핵 센터와 작은 결정을 초래할 것이다.
위에서 설명한 방법은 기술적 복잡성, 제어 수준 및 강수 과정의 속도에 차이가 있습니다. 혼합 방법은 이중 제트 및 3 셀 시스템 모두에 대한 특수 셋업 6이 필요합니다. 혼합 방법에서, 다른 수용성 카운터 이온(예를 들어, Na+Cl–)6의 존재는 불가피한 반면, 기타노 방법에서는 칼슘 및 (비) 탄산염이 용액의 유일한 이온이며 추가적인 이온의 존재를 수반하지 않는다. 카운터 이온(예: Na+Cl–). 또한, 혼합 방법은 상대적으로 큰 양을 필요로하므로 고가의 바이오 폴리머로 작업하기에 적합하지 않습니다. 이중 제트의 장점은 용액 주입속도를 조절할 수 있고 다른 방법에 비해 빠른 공정이라는 점입니다.
키타노 방법과 증기 확산 방법의 장점은 탄산칼슘의 형성이 CaCl2 용액의 CO2 내/아웃확산에 의해 제어되어 더 느린 핵 형성 및 침전 과정을 조사할 수 있다는 것입니다. 11세 , 12.또한, CO2의 확산에 의한 탄산칼슘 형성은 생체 내 석회화과정(13,14,15)과유사할 수 있다. 이 방법에서는 잘 정의되고 분리 된 결정이 형성됩니다16. 마지막으로, 탄산칼슘 형성에 대한 단일 또는 다중 바이오 폴리머의 효과를 테스트할 수 있습니다. 이를 통해 탄산칼슘 형성에 대한 일련의 첨가제 농도의 영향뿐만 아니라 생체 고분자 혼합물에 대한 연구가 모두 통제된 방식으로 수행됩니다. 이 방법은 다양한 농도 및 부피가 첨가제와 함께 사용하기에 적합합니다. 사용되는 최소 부피는 약 50 μL이므로 사용 가능한 생체 고분자의 양이 제한된 경우 이 방법이 유리합니다. 최대 부피는 더 큰 웰 플레이트또는 CaCl 2를 포함하는 플레이트 또는 비커를 삽입할 건조기의 접근성에 따라 달라집니다. 아래에 설명된 방법은 단백질 TapA17로선택된 생체 고분자를 가진 96웰 플레이트에서 작동하도록 최적화되었습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명된 방법은 유기 첨가제의 존재 에서 탄산 칼슘 결정을 형성하고 생체 외에서 탄산 칼슘 결정의 형태 및 구조에 대한 유기 생체 고분자의 효과를 평가하는 것을 목표로합니다. 상기 방법은 대조군 실험에서 형성된 방해석 결정에 유기 첨가제의 존재에 형성된 결정의 비교에 기초한다. 우리는 탄산 칼슘 결정을 형성하는 확산 방법을 사용하는 방법, 광학 및 전자 현미경을 사용하여 자신…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자들은 리아 아다디 교수, 조나단 에레즈 교수, 야엘 폴리티 박사에게 유익한 토론에 감사드립니다. 이 연구는 이스라엘 과학 재단 (ISF)에 의해 지원되었습니다, 부여 1150/14.
Materials
| Acetic acid | Gadot | 64-19-7 | |
| Ammonium carbonate | Sigma-Aldrich | 506-87-6 | |
| Calcium chloride dihydrate | Merck KGaA | 10035-04-8 | |
| Ethanol Absolute | Gadot | 64-17-5 | |
| Micro-Raman | Renishaw | inVia Reflex spectrometer coupled with an upright Leica optical microscope | |
| Microscope | Nikon | Eclipse 90i model | |
| Nis elements Br software | Nikon | For microscope imaging | |
| Scanning Electron Microscope | ThermoFisher Scientific | FEI Sirion microscope | |
| Spectrophotometer | JASCO | V-670 model | |
| Sputter coater | Polaron | SC7640 model |
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