रेबीज वैक्सीन शक्ति का मूल्यांकन करने के लिए विट्रो एलिसा टेस्ट में
Summary
यहां हम रेबीज टीकों में इम्यूनोजेनिक ग्लाइकोप्रोटीन सामग्री निर्धारित करने के लिए एक अप्रत्यक्ष एलिसा सैंडविच इम्यूनोकैप्चर का वर्णन करते हैं। यह परीक्षण ग्लाइकोप्रोटीन ट्रिमर्स को पहचानने वाले एक बेअसर मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (mAb-D1) का उपयोग करता है। यह उत्पादन के दौरान वैक्सीन शक्ति की निरंतरता का पालन करने के लिए वीवो एनआईएच परीक्षण में एक विकल्प है।
Abstract
पशु कल्याण के लिए बढ़ती वैश्विक चिंता निर्माताओं और राष्ट्रीय नियंत्रण प्रयोगशालाओं (OMCLs) को प्रयोगशाला पशु परीक्षण के प्रतिस्थापन, कमी और शोधन के लिए 3Rs रणनीति का पालन करने के लिए प्रोत्साहित कर रही है । रेबीज वैक्सीन शक्ति के मूल्यांकन के लिए एनआईएच परीक्षण के विकल्प के रूप में डब्ल्यूएचओ और यूरोपीय स्तर पर इन विट्रो दृष्टिकोणों के विकास की सिफारिश की जाती है। रेबीज वायरस (RABV) कण की सतह पर, ग्लाइकोप्रोटीन के ट्रिमर्स वायरल बेअसर एंटीबॉडी (VNAbs) को प्रेरित करने के लिए प्रमुख इम्यूनोजेन का गठन करते हैं। एलिसा परीक्षण, जहां मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (mAb-D1) को बेअसर करने वाला ग्लाइकोप्रोटीन के ट्रिमरिक रूप को पहचानता है, वैक्सीन बैचों के उत्पादन के साथ देशी जोड़ ट्रिमेरिक ग्लाइकोप्रोटीन की सामग्री निर्धारित करने के लिए विकसित किया गया है। यह इन विट्रो शक्ति परीक्षण ने एनआईएच परीक्षण के साथ एक अच्छा सामंजस्य प्रदर्शित किया और RABV वैक्सीन निर्माताओं और OMCLs द्वारा सहयोगात्मक परीक्षणों में उपयुक्त पाया गया है। निकट भविष्य में पशु उपयोग से बचना एक प्राप्त करने योग्य उद्देश्य है।
प्रस्तुत विधि एमएबी-डी 1 का उपयोग करके एक अप्रत्यक्ष एलिसा सैंडविच इम्यूनोकैप्चर पर आधारित है जो ट्रिमेरिक रैब्व ग्लाइकोप्रोटीन यानी इम्यूनोजेनिक रैब्वी एंटीजन की एंटीजेनिक साइट्स III (एए 330 से 338) को पहचानती है। एमएबी-डी 1 का उपयोग वैक्सीन बैच में मौजूद ग्लाइकोप्रोटीन ट्रिमर्स को कोटिंग और डिटेक्शन दोनों के लिए किया जाता है। चूंकि एपिटोप को इसके संरचनात्मक गुणों के कारण पहचाना जाता है, इसलिए संभावित रूप से विकृत ग्लाइकोप्रोटीन (कम इम्यूनोजेनिक) को mAb-D1 द्वारा कैप्चर और पता नहीं लगाया जा सकता है। परीक्षण किए जाने वाले टीके को एमएबी-डी 1 के साथ संवेदनशील प्लेट में इनक्यूबेटेड किया जाता है । बाउंड ट्रिमरिक रैबवी ग्लाइकोप्रोटीन की पहचान एमएबी-डी 1 को फिर से जोड़कर की जाती है, जो पेरोक्सिडेस के साथ लेबल किया जाता है और फिर सब्सट्रेट और क्रोमोजन की उपस्थिति में पता चला जाता है। परीक्षण किए गए टीके और संदर्भ वैक्सीन के लिए मापा अवशोष की तुलना इम्यूनोजेनिक ग्लाइकोप्रोटीन सामग्री के निर्धारण के लिए अनुमति देता है।
Introduction
50 से अधिक वर्षों के बाद से, एनआईएच परीक्षण1 बैच रिलीज से पहले रेबीज वैक्सीन शक्ति का मूल्यांकन करने के लिए सोने के मानक विधि के रूप में उपयोग किया जाता है। इस परीक्षण में चूहों के समूहों का इंट्रापेरिटोनियल प्रतिरक्षण होता है, जिसका परीक्षण किया जाना है और इसके बाद 14 दिन बाद रेबीज वायरस (आरएबीवी) के चैलेंज वायरस स्टैंडर्ड (सीवीएस) तनाव के साथ इंट्रा-सेरेब्रल (आईसी) चैलेंज होता है। शक्ति का मूल्यांकन आईसी चुनौती से जीवित चूहों के अनुपात से किया जाता है। हालांकि डब्ल्यूएचओ2 और यूरोपीय फार्माकोपिया3 को अभी भी वैक्सीन शक्ति का आकलन करने के लिए एनआईएच परीक्षण की आवश्यकता होती है, लेकिन यह परीक्षण कई बाधाएं झेलता है: परिणाम अत्यधिक परिवर्तनशील4हैं; संक्रामक RABV चुनौती के दौरान प्रयोग किया जाता है और यह दोनों तकनीकी कौशल और सख्त जैव सुरक्षा उपायों की आवश्यकता है; जानवरों की बड़ी संख्या का उपयोग किया जाता है, और चुनौती की गंभीरता गंभीर नैतिक चिंताओंकोउठाती 5 . इस परीक्षण की एक कम गंभीर भिन्नता विकसित की गई है: इंट्रा-पेरिटोनियल प्रतिरक्षण के दो सप्ताह बाद, चूहों को आईसी द्वारा चुनौती नहीं दी जाती है, लेकिन चूहों को इन विट्रो बेअसरीकरण परीक्षण का उपयोग करके अपने सीरम में विशिष्ट राबवी बेअसर एंटीबॉडी (वीएनएबी) की उपस्थिति के लिए ब्लेड और परीक्षण किया जाता है। हालांकि, इस परीक्षण के लिए अभी भी बड़ी संख्या में प्रयोगशाला चूहों का त्याग करने की आवश्यकता8है, हालांकि यह पहले से ही पशु चिकित्सा टीकों6,,7 के लिए उपयोग में है और मानव टीके 8 के लिए माना जाता है।
अभी तक, दोनों अंतरराष्ट्रीय9 और यूरोपीय10 सिफारिशों निर्माताओं और राष्ट्रीय नियंत्रण प्रयोगशालाओं (सरकारी चिकित्सा नियंत्रण प्रयोगशालाओं-OMCLs) को प्रतिस्थापन, कमी, और प्रयोगशाला पशु परीक्षण के शोधन को लागू करने के लिए प्रोत्साहित करते हैं, 3Rs रणनीति के रूप में संदर्भित । यूरोपीय निर्देश 2010/63/यूरोपीय संघ (2013/01/01 के बाद से लागू) पशुओं की सुरक्षा और कल्याण से संबंधित भी वैक्सीन निर्माताओं और रेबीज टीकों की गुणवत्ता नियंत्रण में शामिल प्रयोगशालाओं के साथ ही रेबीज अनुसंधान11में बाधाओं को मजबूत किया है । नतीजतन, विकास, सत्यापन, और वैकल्पिक इन विट्रो दृष्टिकोण का उपयोग अब एक प्राथमिकता बन गए हैं । ये न केवल नैतिकता की दृष्टि से ध्वनि हैं बल्कि बैच परीक्षण लागत को भी कम कर सकते हैं और परिणामों के लिए समय कोसप्ताह 3के बजाय घंटों तक कम कर सकते हैं ।
राबव कण की सतह पर ग्लाइकोप्रोटीन एक ट्रिमरिक रूप,12, 13,14,1515,16को अपनाता है । रेबीज वैक्सीन में, यह देशी त्रिमेरिक रूप वीएनएबीएस17 को प्रेरित करने वाला प्रमुख इम्यूनोजेन है जबकि मोनोमेरिक, घुलनशील या विकृत ग्लाइकोप्रोटीन खराब इम्यूनोजेनिक18,,19हैं। इस प्रकार, वैक्सीन उत्पादन प्रक्रिया के साथ ग्लाइकोप्रोटीन के ट्रिमर्स का संरक्षण एक इष्टतम इम्यूनोजेनिक क्षमता के संरक्षण के लिए एक अच्छा संकेतक है। एंटीबॉडी-बाध्यकारी-परीक्षण20,,21,एकल रेडियल इम्यूनोडिफ्यूजन (एसआरडी) परीक्षण22 और एलिसा परीक्षण23,24,,25,,26,,27 जैसे कई इम्यूनोकेमिकल विधियों की सिफारिश डब्ल्यूएचओ तकनीकी रिपोर्ट श्रृंखला2 और यूरोपीय मोनोग्राफ3 द्वारा रेबीज टीकों में एंटीजन सामग्री की मात्रा निर्धारित करने के लिए की जाती है ।, इनका उपयोग निर्माताओं द्वारा टीका उत्पादन की निरंतरता की निगरानी करने के लिए और ओएमसीएल द्वारा मानव टीकों28के बैचों के लगातार निर्माण का आकलन करने के लिए किया जाताहै, भले ही एनआईएच परीक्षण अभी भी शक्ति के लिए माना जाता हो।
हालांकि, ये सभी इम्यूनोकेमिकल तरीके बराबर नहीं हैं। एसआरडी परीक्षण के लिए पूर्व-उपचार की आवश्यकता होती है जो झिल्ली-लंगर वाले ट्रिमर्स को बदल सकता है और परिणामस्वरूप ग्लाइकोप्रोटीन22,29का घुलनशील या विकृत रूप हो सकता है। इसलिए, एसआरडी इम्यूनोजेनिक और गैर-इम्यूनोजेनिक ग्लाइकोप्रोटीन के बीच भेदभाव करने में अधिक कुशल नहीं है जिसके परिणामस्वरूप टीका की इम्यूनोजेनिकिटी का अपूर्ण मूल्यांकन होता है। इसके विपरीत, एलिसा परीक्षण अधिक संवेदनशील22है, ग्लाइकोप्रोटीन की मूल संरचना को बरकरार रखता है, और ग्लाइकोप्रोटीन के मूल रूप से मुड़ा हुआ ट्रिमर्स की सामग्री निर्धारित करने के लिए अधिक उपयुक्त है। एलिसा परीक्षण या तो खरगोश पॉलीक्लोनल या माउस मोनोक्लोनल एंटी-ग्लाइकोप्रोटीन एंटीबॉडी का उपयोग शुद्ध या अमोनियम सल्फेट के साथ केंद्रित कर सकता है। अध्ययनों ने टीकों में एलिसा द्वारा मूल्यांकन किए गए एनआईएच परीक्षण और एंटीजन सामग्री के बीच अच्छा सामंजस्य प्रदर्शित किया है और निष्कर्ष निकाला है कि एलिसा विधियां इन विट्रो शक्ति परीक्षण के लिए उपयुक्त हैं। यह इस बात की वकालत करता है कि एलिसा परीक्षण कम से कम एनआईएच,परीक्षण4,26,27,30,31,32,33को पूरक या प्रतिस्थापित भी कर सकती है . आज, यूरोपीय फार्माकोपोइया एनआईएच परीक्षण3के विकल्प के रूप में मान्य सीरोलॉजिकल या इम्यूनोकेमिकल परख के उपयोग की सिफारिश करता है। वैक्सीन शक्ति के लिए पशु उपयोग का पूर्ण परिहार एक यथार्थवादी परिप्रेक्ष्य बन गया है।
नीचे प्रस्तुत विधि एक अप्रत्यक्ष एलिसा सैंडविच इम्यूनोकैप्चर पर आधारित है एक माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी क्लोन (mAb-D1) का उपयोग करजो एंटीजेनिक साइटों III (एए 330 से 338) को पहचानता है ट्रिमरिक राबवी ग्लाइकोप्रोटीन15,,34। इस विधि को शुरू में इंस्टीट्यूट पाश्चर26,,30 में विकसित किया गया था, फिर एग्नेस नेशनल डी सेक्यूरिटे डु मेडडिकामेंट एट डेस प्रोड्यूस डी सैंटे (एएनएम) प्रयोगशाला, यानी फ्रेंच ओएमजीएल4,,33द्वारा अनुकूलित और मान्य किया गया था। MAb-D1 दोनों थाली संवेदनशील और बाद में कब्जा कर लिया एंटीजन का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है । यह ग्लाइकोप्रोटीन ट्रिमर्स यानी इम्यूनोजेनिक राबवी एंटीजन के विशिष्ट क्वांटिफिकेशन के लिए अनुमति देता है। पता लगाने के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले एमएबी-डी 1 को पेरोक्सिडेस के साथ लेबल किया गया है, जो सब्सट्रेट और क्रोमोजन की उपस्थिति में पता चला है । परीक्षण किए गए टीके और संदर्भ वैक्सीन के लिए मापा अवशोष की तुलना इम्यूनोजेनिक ग्लाइकोप्रोटीन सामग्री के निर्धारण के लिए अनुमति देता है। यह ध्यान देने योग्य है कि रैबवी ग्लाइकोप्रोटीन35की विभिन्न एंटीजेनिक साइटों को पहचानने के लिए एक ही प्रकार की परख लागू की जा सकती है । अमोनियम सल्फेट एंटी-ग्लाइकोप्रोटीन पॉलीक्लोनल खरगोश इम्यूनोग्लोबुलिन जी (आईजीजी) या मोनोक्लोनल माउस ग्लोब्यूलिन के साथ प्राप्त करने और शुद्ध करने या ध्यान केंद्रित करने की विधि को पेरिक्सिडाज़37के साथ एंटीबॉडी को संजोने की विधि के साथ-साथ पहले36 वर्णित किया गयाहै।
Protocol
Representative Results
Discussion
एमएबी-डी 1 द्वारा मान्यता प्राप्त एपिटोप आरएबीवी ग्लाइकोप्रोटीन की एंटीजेनिक साइट III में स्थित है जो न केवल वीएनएबीएस को शामिल करने के लिए इम्यूनो-प्रभावी है बल्कि न्यूरोविरुअलिटी, रोगजनकता40,</sup…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
डॉ सिल्वी मोर्जेस और डॉ जीन-मिशेल चैपसल को वैक्सीन बैचों पर एलिसा परख स्थापित करने और अंतरराष्ट्रीय कार्यशालाओं और सहयोगात्मक अध्ययनों को व्यवस्थित करने के लिए उनकी प्रमुख भागीदारी के लिए स्वीकार किया जाना चाहिए । पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पठन-पाठन के लिए हम सबरीना काली को धन्यवाद देते हैं । डॉ पियरे पेरिन एमएबी-डी 1 के अलगाव और लक्षण वर्णन के लिए जिम्मेदार थे। इस काम को मुख्य रूप से इंस्टीटयूट पाश्चर फंडिंग ने सपोर्ट किया है ।
Materials
| Class II Biological Safety Cabinet | ThermoFisher Scientific | 10445753 | if titrating live virus |
| Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates, 400 µL, MAXISORP | ThermoFisher Scientific | 439454 | good for binding to the loaded antibody |
| Equip Labo Polypropylene Laboratory Fume Hood | ThermoFisher Scientific | 12576606 | for the preparation of sulfuric acid |
| Immunology Plate Strong Adsorption MAXISORP Flat Bottom Well F96 |
Dutscher | 55303 | good for binding to the loaded antibody |
| Microplate Sealing Tape(100 sheets) | ThermoFisher Scientific | 15036 | |
| Microplate single mode reader Sunrise | TECAN | ||
| Microplate shaker-incubator | Dutscher | 441504 | |
| Microplate washer Wellwash | ThermoFisher Scientific | 5165000 | |
| Multichannel pipette (30-300 µL) 12 channels | ThermoFisher Scientific | 4661180N | |
| Single Channel pipettes (Kit 2 : Finnpipettes F2 0.2-2 μL micro, 2-20 μL, 20-200 μL & 100-1000 μL) | ThermoFisher Scientific | 4700880 |
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