JoVE Journal > Immunology and Infection
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Abstract
Introduction
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Immunologie et infection

광견병 백신 효능을 평가하기 위한 시험관 내 ELISA 테스트

Published: May 11, 2020
doi:
10.3791/59641
,
1Unit Antiviral Strategies, OIE Reference Laboratories for Rift Valley Fever Virus & Crimean Congo Hemorrhagic Fever Virus,Institut Pasteur, 2Institut Pasteur de Guinée, Conakry

Summary

여기에서 우리는 광견병 백신에 있는 면역원성 당단백질 내용을 결정하기 위하여 간접적인 ELISA 샌드위치 면역 포착을 기술합니다. 이 시험은 당단백질 트리머를 인식하는 중화 단일클론 항체(mAb-D1)를 사용한다. 그것은 생산 하는 동안 백신 힘의 일관성을 따라 생체 내 NIH 테스트에 대 한 대안.

Abstract

동물 복지에 대한 전 세계적으로 증가하는 관심사는 제조업체와 국립 통제 연구소(OMCL)가 실험실 동물 실험의 교체, 감소 및 개선을 위한 3R 전략을 따르도록 장려하고 있습니다. 시험관 내 접근법의 개발은 광견병 백신 효능을 평가하기위한 NIH 테스트의 대안으로 WHO 및 유럽 수준에서 권장됩니다. 광견병 바이러스 (RABV) 입자의 표면에서, 당단백질의 트리머는 바이러스 중화 항체 (VNAbs)를 유도하는 주요 면역 원을 구성한다. 중화 단일 클론 항체 (mAb-D1)는 당단백질의 트리메라 형태를 인식하는 ELISA 테스트는 백신 배치의 생산과 함께 네이티브 접힌 트리메릭 당단백질의 함량을 결정하기 위해 개발되었습니다. 이 시험관 내 효능 시험은 NIH 테스트와 양호한 일치를 입증했으며 RABV 백신 제조업체 및 OMcLs의 공동 시험에서 적합한 것으로 밝혀졌습니다. 동물 사용의 회피는 가까운 장래에 달성 가능한 목표입니다.

제시된 방법은 트리메릭 RABV 당단백질, 즉 면역원성 RABV 항원의 항원 부위 III(aa 330 to 338)를 인식하는 mAb-D1을 이용한 간접 ELISA 샌드위치 면역포지에 기초한다. mAb-D1은 백신 배치에 존재하는 당단백질 트리머의 코팅 및 검출 모두에 사용됩니다. 에피토프는 그것의 형태 특성 때문에 인식되기 때문에, 잠재적으로 변성된 당단백질 (더 적은 면역원성)은 mAb-D1에 의해 포착되고 검출될 수 없습니다. 시험되는 백신은 mAb-D1로 민감화된 플레이트에서 배양된다. 바운드 트리메릭 RABV 당단백질은 mAb-D1을 다시 첨가하여 확인되고, 과산화아제로 표지된 다음 기질 및 크로모겐의 존재에서 밝혀낸다. 시험된 백신 및 기준 백신에 대해 측정된 흡광도의 비교는 면역원성 당단백질 함량의 측정을 가능하게 한다.

Introduction

50년 이상 부터, NIH 시험1은 일괄 방출 전에 광견병 백신 효능을 평가하는 금 본위제 방법으로 사용된다. 이 시험은 광견병 바이러스 (RABV)의 도전 바이러스 표준 (CVS) 긴장으로 14 일 후에 시험될 백신을 가진 마우스의 군의 복강 내 면역으로 이루어져 있습니다. 효능은 IC 도전에서 살아남은 마우스의 비율에서 평가됩니다. WHO2 와 유럽 약전3은 여전히 백신 효능을 평가하기위한 NIH 테스트를 필요로하지만,이 테스트는 몇 가지 장애물을 겪습니다 : 결과는 매우 가변적4; 전염성 RABV는 도전 도중 사용되며 이것은 기술적 인 기술과 엄격한 생물 안전 조치를 모두 필요로합니다. 많은 수의 동물이 사용되고 있으며, 도전의 심각성은 심각한 윤리적 우려를제기5. 이 시험의 보다 적게 가혹한 변이는 개발되었습니다: 복막 내 면역 화 후에 2 주, 마우스는 IC에 의해 도전되지 않습니다 그러나 시험관외 중화 시험을 사용하여 그들의 혈청에 있는 특정 RABV 중화 항체 (VNAbs)의 존재를 위해 시험을 보았습니다. 그러나, 이 시험은 이미 수의학 백신6,,7에 사용되고 인간 백신8에대해 고려되고 있지만 많은 수의 실험실 마우스를 희생해야한다.

현재, 국제9 및 유럽10 권고 는 제조 업체와 국가 제어 실험실을 장려 (공식 의학 제어 실험실 – OMCLs) 실험실 동물 테스트의 교체를 구현, 감소, 그리고 실험실 동물 테스트의 정제, 3Rs 전략으로 언급. 동물의 보호 및 복지와 관련된 유럽 지침 2010/63/EU(2013/01/01 이후 발효)는 광견병 백신의 품질 관리및 광견병 연구11에관련된 백신 제조업체 및 실험실에 대한 제약을 강화했습니다. 그 결과, 시험관 내 대체 접근법의 개발, 검증 및 사용이 이제 우선 순위가 되었습니다. 이들은 윤리적으로 건전할 뿐만 아니라 배치 테스트 비용을 줄이고 결과 에 대한 시간을3주가아닌 시간으로 단축할 수 있습니다.

RABV 입자의 표면에서 당단백질은 트리메라 형태12,,13,,14,,15,,16을채택합니다. 광견병 백신에서, 이러한 네이티브 트리메릭 형태는VNAbs(17)를 유도하는 주요 면역원을 구성하는 반면, 단용성, 용해성 또는 변성당단백질은 면역원성이 불량한18,,19이다. 따라서, 백신 생산 공정에 따른 당단백질의 트리머의 보존은 최적의 면역원성 전위보존을 위한 좋은 지표이다. 항체 결합 시험20,,21,단일 방사형 면역이디퓨전(SRD) 시험22 및 ELISA 시험23,,24,,25,,26,,27과 같은 몇몇 면역화학적 방법은 광견병 백신의 항원 함량을 정량화하기 위해 WHO 기술 보고서 시리즈2 및 유럽 논문3에 의해 권장된다. 이들은 NIH 시험이 아직도 힘에 대하여 고려되더라도, 인간 백신28의, 배치의 일관된 배합을 평가하기 위하여 백신 생산의 일관성을 감시하기 위하여 제조자에 의해 이용됩니다.

그러나, 이러한 모든 면역 화학 적 방법은 동일하지 않습니다. 상기 SRD 시험은 막 고정 된 트리머를 변경하고 당단백질22,,29의용해성 또는 변성 형태를 초래할 수있는 전처리를 필요로한다. 따라서, SRD는 면역 원성 및 비 면역 원성 당단백질 사이의 차별에 많은 효율적이지 못하여 백신 부지의 면역 원내성에 대한 불완전한 평가를 초래한다. 대조적으로, ELISA 시험은22더 민감하고, 당단백질의 기본 구조를 보존하고, 당단백질의 기본적으로 접힌 삼량분의 함량을 결정하는 것이 더 적절하다. ELISA 시험은 토끼 폴리클로날 또는 마우스 단일클론 항당단백질 항체를 정제하거나 황산암모늄으로 농축하여 사용할 수 있다. 연구는 백신에서 ELISA에 의해 평가된 NIH 시험과 항원 함량 사이 좋은 일치를 보여주었고 ELISA 방법은 시험관 내 힘 시험에 적합하다는 결론을 내렸습니다. 이것은 ELISA 시험이 적어도 보충하거나 NIH 시험4,26,27,,,30,,31,,32,,33을대체할 지도 모른다는 것을 옹호합니다., 오늘, 유럽 약리학은 NIH 시험3에대한 대안으로 검증 된 혈청학 또는 면역 화학 분석법의 사용을 권장합니다. 백신 효능에 대한 동물 사용의 완전한 회피는 현실적인 관점이되었다.

하기 제시된 방법은 삼각약 RABV 당단백질15,,34의항원 부위 III(aa 330 to 338)를 인식하는 마우스 단일클론 항체 클론(mAb-D1)을 이용한 간접 ELISA 샌드위치 면역포착에 기초한다. 이 방법은 처음에 개발되었다 연구소 파스퇴르26,30 다음 최적화 및 기관 국립 에 의해 검증 세큐리테 뒤 메디카멘트 et des produits 드 산테 (ANSM) 실험실, 즉, 프랑스 OMCL4,33. mAb-D1은 플레이트를 과민화하고 이어서 포획된 항원을 검출하기 위해 모두 사용된다. 이는 당단백질 트리머, 즉 면역원성 RABV 항원의 특이적 정량화를 허용한다. 검출에 사용되는 mAb-D1은 기질 및 크로모겐의 존재 에서 밝혀지는 과산화아제로 표지된다. 시험된 백신 및 기준 백신에 대해 측정된 흡광도의 비교는 면역원성 당단백질 함량의 측정을 가능하게 한다. RABV당단백질(35)의상이한 항원 부위를 인식하는 상이한 mAbs에 동일한 유형의 분석이 적용될 수 있다는 점에 유의한다. 상기 방법은 황산암모늄을 황산염 항당단백질 폴리클로날 토끼 G(IgG) 또는 모노클로날 마우스 글로불린으로 획득 및 정제 또는 농축하는방법(37)과 함께 이전에 광범위하게 기술되어 왔다37..

Protocol

1. 보안 예방 조치 참고: 이 방법은 살아있는 RABV 및 불활성화 백신 모두에 적용됩니다. 좋은 실험실 실습 및 안전 절차를 사용하십시오. 일회용 코트, 장갑, 마스크, 안경 등을 포함한 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용하십시오. 살아있는 바이러스가 적정되면, 클래스 II 생물학적 안전 캐비닛을 사용한다. 시료(시약, 세척용액 등)와 접촉하는 모든 ?…

Representative Results

다음 예에서 정제된 불활성화 광견병 바이러스 입자(PV 백신 균주)로 구성된 참조 백신 Lot 09가 사용된다. 이에 대한 당단백질 트리머(10 μg/mL) 함량은 총 바이러스 성 단백질(BCA 시험)의 측정 및 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의한 당단백질의 백분율의 평가 후에 확립되었다. 대안적으로, 교정된 기준 백신, 예를 들어, 광견병 백신에 대한 WHO6th 국제 표준(IS)(NIB…

Discussion

mAb-D1에 의해 인식된 에피토프는 RabV 당단백질의 항원 부위 III에 위치하며 이는 VNAbs의 유도를 위한 면역 지배적일 뿐만 아니라 또한 신경성, 병원성40,,41 및 수용체인식에관여한다. 당단백질, 부위 II43을따라 또 다른 중요한 항원 부위가 있는데, 이에 대해 mAb-WI-111235와같은 여러 MAb가 분리되었다. 이?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

실비 모르게오 박사와 장 미셸 채프살 박사는 백신 배치에 대한 ELISA 분석 결과를 확립하고 국제 워크샵 및 공동 연구를 조직하기 위해 주요 참여를 인정받아야 합니다. 우리는 원고의 비판적 독서사브리나 칼리에게 감사드립니다. 피에르 페린 박사는 mAb-D1의 격리와 특성화를 담당했습니다. 이 작품은 주로 인스티투트 파스퇴르 자금조달에 의해 지원되고 있습니다.

Materials

Class II Biological Safety Cabinet ThermoFisher Scientific 10445753 if titrating live virus
Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates, 400 µL, MAXISORP ThermoFisher Scientific 439454 good for binding to the loaded antibody
Equip Labo Polypropylene Laboratory Fume Hood ThermoFisher Scientific 12576606 for the preparation of sulfuric acid
Immunology Plate Strong
Adsorption MAXISORP Flat Bottom
Well F96		 Dutscher 55303 good for binding to the loaded antibody
Microplate Sealing Tape(100 sheets) ThermoFisher Scientific 15036
Microplate  single mode reader Sunrise TECAN
Microplate shaker-incubator Dutscher 441504
Microplate washer Wellwash ThermoFisher Scientific 5165000
Multichannel pipette (30-300 µL) 12 channels ThermoFisher Scientific 4661180N
Single Channel pipettes (Kit 2 : Finnpipettes F2 0.2-2 μL micro, 2-20 μL, 20-200 μL & 100-1000 μL) ThermoFisher Scientific 4700880
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References

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Citer Cet Article
Jallet, C., Tordo, N. In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency. J. Vis. Exp. (159), e59641, doi:10.3791/59641 (2020).
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