Prueba IN Vitro ELISA para evaluar la potencia de la vacuna contra la rabia
Summary
Aquí describimos una inmunocaptura indirecta de sándwich ELISA para determinar el contenido de glicoproteína inmunogénica en las vacunas contra la rabia. Esta prueba utiliza un anticuerpo monoclonal neutralizante (mAb-D1) que reconoce los recortadores de glicoproteína. Es una alternativa a la prueba in vivo de NIH para seguir la consistencia de la potencia de la vacuna durante la producción.
Abstract
La creciente preocupación mundial por el bienestar animal está alentando a los fabricantes y a los Laboratorios Nacionales de Control (OMCL) a seguir la estrategia 3R s para la sustitución, reducción y refinamiento de las pruebas en animales de laboratorio. Se recomienda el desarrollo de enfoques in vitro a nivel de la OMS y europa como alternativas a la prueba de NIH para evaluar la potencia de la vacuna contra la rabia. En la superficie de la partícula del virus de la rabia (RABV), los recortadores de glicoproteína constituyen el principal inmunogen para inducir anticuerpos neutralizantes virales (VNAbs). Se ha desarrollado una prueba ELISA, en la que los anticuerpos monoclonales neutralizantes (mAb-D1) reconocen la forma trimérica de la glicoproteína, para determinar el contenido de la glicoproteína trimérica plegada nativa junto con la producción de los lotes de vacunas. Esta prueba de potencia in vitro demostró una buena concordancia con la prueba de NIH y se ha encontrado adecuada en ensayos colaborativos por fabricantes de vacunas RABV y CLUFs. Evitar el uso animal es un objetivo alcanzable en un futuro próximo.
El método presentado se basa en una inmunocaptura de sándwich ELISA indirecta utilizando el mAb-D1 que reconoce los sitios antigénicos III (aa 330 a 338) de la glicoproteína RABV trimérica, es decir, el antígeno RABV inmunogénico. mAb-D1 se utiliza tanto para el recubrimiento como para la detección de recortadores de glicoproteína presentes en el lote de vacunas. Dado que el epítopo es reconocido debido a sus propiedades conformacionales, la glicoproteína potencialmente desnaturalizada (menos inmunogénica) no puede ser capturada y detectada por el mAb-D1. La vacuna a probar se incuba en una placa sensificada con el mAb-D1. Las glicoproteínas RABV recortadas enlazadas se identifican añadiendo el mAb-D1 de nuevo, etiquetado con peroxidasa y luego revelado en presencia de sustrato y cromógeno. La comparación de la absorbancia medida para la vacuna probada y la vacuna de referencia permite la determinación del contenido de glicoproteína inmunogénica.
Introduction
Desde hace más de 50 años, la prueba1 de NIH se utiliza como método estándar de oro para evaluar la potencia de la vacuna contra la rabia antes de la liberación por lotes. Esta prueba consiste en una inmunización intraperitoneal de grupos de ratones con la vacuna que se va a probar seguida de un desafío intracerebral (IC) 14 días después con la cepa del virus Challenge (CVS) del virus de la rabia (RABV). La potencia se evalúa a partir de la proporción de ratones que sobreviven al desafío IC. Aunque la OMS2 y la Farmacopea Europea3 todavía requieren la prueba de NIH para evaluar la potencia de la vacuna, esta prueba sufre varios obstáculos: los resultados son muy variables4; RABV infeccioso se utiliza durante el desafío y esto requiere tanto la habilidad técnica como estrictas medidas de bioseguridad; se utilizan un gran número de animales, y la gravedad del desafío plantea serias preocupaciones éticas5. Se ha desarrollado una variación menos grave de esta prueba: dos semanas después de la inmunización intraperitoneal, los ratones no son desafiados por IC, sino que se desangran y se analizan para detectar la presencia de anticuerpos neutralizantes RABV específicos (VNAbs) en su suero mediante una prueba de neutralización in vitro. Sin embargo, esta prueba todavía requiere sacrificar un gran número de ratones de laboratorio, aunque ya está en uso para las vacunas veterinarias6,7 y se ha considerado para vacunas humanas8.
A partir de ahora, tanto las recomendacionesInternacionales 9 como las10 Europeas alientan a los fabricantes y a los Laboratorios Nacionales de Control (Laboratorios Oficiales de Control de Medicina – Omcl) a implementar la estrategia de reemplazo, reducción y refinamiento de pruebas en animales de laboratorio, denominada estrategia 3R. La Directiva Europea 2010/63/UE (en vigor desde 2013/01/01) relativa a la protección y el bienestar de los animales también ha reforzado las limitaciones para los fabricantes de vacunas y los laboratorios que participan en el control de calidad de las vacunas contra la rabia, así como en la investigación de la rabia11. Como resultado, el desarrollo, la validación y el uso de enfoques in vitro alternativos se han convertido en una prioridad. Estos no sólo son éticamente sólidos, sino que también pueden reducir los costos de pruebas por lotes y acortar el tiempo para los resultados a horas en lugar de semanas3.
En la superficie de la partícula RABV, la glicoproteína adopta una forma trimrica12,13,14,15,16. En la vacuna antirrábica, esta forma trimérica nativa constituye el principal vNAbs inductor de inmunogenes17, mientras que las glicoproteínas monoméricas, solubles o desnaturalizadas son poco inmunogénicas18,19. Por lo tanto, la preservación de los recortadores de la glicoproteína a lo largo del proceso de producción de la vacuna es un buen indicador para la preservación de un potencial inmunogénico óptimo. Varios métodos inmunoquímicos, como la prueba de unión de anticuerpos20,21, la prueba22 de inmunodifusión radial única y la prueba ELISA23,24,25,26,27 son recomendados por la serie2 de informes técnicos de la OMS y la monografía europea3 para cuantificar el contenido de antígeno según las vacunas contra la rabia. Estos son utilizados por los fabricantes para monitorear la consistencia de la producción de vacunas y por la OMCL para evaluar la formulación consistente de lotes de vacunas humanas28,, incluso si la prueba de NIH todavía se considera para la potencia.
Sin embargo, todos estos métodos inmunoquímicos no son equivalentes. La prueba DeSC requiere un pretratamiento que pueda alterar los trimers anclados por membrana y dar lugar a una forma soluble o desnaturalizada de la glicoproteína22,,29. Por lo tanto, la SRD no es muy eficiente para discriminar entre glicoproteínas inmunogénicas y no inmunogénicas, lo que resulta en una evaluación imperfecta de la inmunogenicidad de un lote de vacunas. Por el contrario, la prueba ELISA es más sensible22, conserva la estructura nativa de la glicoproteína, y es más apropiada para determinar el contenido de los trimers plegados de forma nativa de glicoproteína. La prueba ELISA puede utilizar anticuerpos antiglicoproteínamono monoclonales de conejo o monoclonales de ratón purificados o concentrados con sulfato de amonio. Los estudios han demostrado una buena concordancia entre la prueba de NIH y el contenido de antígeno evaluado por ELISA en vacunas y han concluido que los métodos ELISA son adecuados para la prueba de potencia in vitro. Esto aboga por que las pruebas ELISA puedan al menos complementar o incluso reemplazar la prueba4,26,27,30,31,32,33., Hoy en día, la Farmacopea Europea recomienda el uso de ensayos serológicos o inmunoquímicos validados como alternativas a la prueba3de los NIH. La evasión completa del uso animal para la potencia de la vacuna se ha convertido en una perspectiva realista.
El método que se presenta a continuación se basa en una inmunocaptura de sándwich ELISA indirecta utilizando un clon de anticuerpos monoclonales de ratón (mAb-D1) que reconoce los sitios antigénicos III (aa 330 a 338) de la glicoproteína rabórica15,,34. Este método fue desarrollado inicialmente en el Institut Pasteur26,30 luego optimizado y validado por el laboratorio Agence Nationale de Sécurité du Médicament et des produits de santé (ANSM), es decir, el laboratorio francés OMCL4,,33. El mAb-D1 se utiliza tanto para sensibilizar la placa como para detectar posteriormente el antígeno capturado. Esto permite la cuantificación específica de los recortadores de glicoproteína, es decir, el antígeno RABV inmunogénico. El mAb-D1 utilizado para la detección está etiquetado con peroxidasa, que se revela en presencia del sustrato y el cromógeno. La comparación de la absorbancia medida para la vacuna probada y la vacuna de referencia permite la determinación del contenido de glicoproteína inmunogénica. Es de destacar que el mismo tipo de ensayo se puede aplicar para diferentes mAbs que reconocen diferentes sitios antigénicos de la glicoproteína RABV35. El método para obtener y purificar o concentrarse con globulinas policlonales de conejo policlonal de sulfato de amonio G (IgG) o monoclonales han sido ampliamente descritos anteriormente36 junto con el método para conjugar anticuerpos con peroxidasa37..
Protocol
Representative Results
Discussion
El epítopo reconocido por el mAb-D1 se encuentra en el sitio antigénico III de la glicoproteína RABV, que no sólo es inmunodominante para la inducción de VNAbs, sino que también participa en neurovirulencia, patogenicidad40,,41 y reconocimiento de receptores42. Hay otro sitio antigénico importante a lo largo de la glicoproteína, sitio II43, contra el cual se han aislado varios MAbs como mAb-WI-1112<sup class…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La Dra. Sylvie Morgeaux y la Dra. Jean-Michel Chapsal deben ser reconocidas por su participación clave para establecer el ensayo ELISA sobre lotes de vacunas y para organizar talleres internacionales y estudios colaborativos. Agradecemos a Sabrina Kali por la lectura crítica del manuscrito. El Dr. Pierre Perrin fue responsable del aislamiento y caracterización de mAb-D1. Este trabajo ha sido apoyado principalmente por la financiación del Instituto Pasteur.
Materials
| Class II Biological Safety Cabinet | ThermoFisher Scientific | 10445753 | if titrating live virus |
| Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates, 400 µL, MAXISORP | ThermoFisher Scientific | 439454 | good for binding to the loaded antibody |
| Equip Labo Polypropylene Laboratory Fume Hood | ThermoFisher Scientific | 12576606 | for the preparation of sulfuric acid |
| Immunology Plate Strong Adsorption MAXISORP Flat Bottom Well F96 |
Dutscher | 55303 | good for binding to the loaded antibody |
| Microplate Sealing Tape(100 sheets) | ThermoFisher Scientific | 15036 | |
| Microplate single mode reader Sunrise | TECAN | ||
| Microplate shaker-incubator | Dutscher | 441504 | |
| Microplate washer Wellwash | ThermoFisher Scientific | 5165000 | |
| Multichannel pipette (30-300 µL) 12 channels | ThermoFisher Scientific | 4661180N | |
| Single Channel pipettes (Kit 2 : Finnpipettes F2 0.2-2 μL micro, 2-20 μL, 20-200 μL & 100-1000 μL) | ThermoFisher Scientific | 4700880 |
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