ラパマイシン/mTOR相互作用を研究するための半定量薬物アフィニティ応答性標的安定性(DARTS)アッセイ
Summary
本研究では、タンパク質安定性の変化をモニタリングし、タンパク質リガンド相互作用の親和性を推定することにより、DARTS実験のデータ解析能力を強化した。相互作用は、プロテオティック曲線と線量依存曲線の 2 つの曲線にプロットできます。例示的なケースとしてmTOR-ラパマイシン相互作用を用いてきた。
Abstract
薬物アフィニティ応答性標的安定性(DARTS)は、新規の低分子タンパク質標的を検出するための堅牢な方法です。これは、既知の低分子タンパク質相互作用を検証し、天然物の潜在的なタンパク質ターゲットを見つけるために使用することができます。他の方法と比較して、DARTSは、ネイティブ、未修飾、低分子を使用し、シンプルで操作が簡単です。本研究では、タンパク質安定性の変化をモニタリングし、タンパク質リガンド相互作用の親和性を推定することにより、DARTS実験のデータ解析能力をさらに強化した。タンパク質-リガンド相互作用は、タンパク質溶解曲線と用量依存曲線の2つの曲線にプロットすることができる。我々は、プロトコルを確立するための模範的なケースとしてmTOR-ラパマイシン相互作用を使用している。プロテオ溶解曲線から、プロナスによるmTORのプロテオ溶解がラパマイシンの存在によって阻害されたことが分かった。用量依存性曲線により、ラパマイシンとmTORの結合親和性を推定することができました。この方法は、新規の標的タンパク質を正確に同定し、薬物標的エンゲージメントを最適化するための強力でシンプルな方法である可能性が高い。
Introduction
低分子標的タンパク質の同定は、潜在的な治療薬1,2,3の機械的理解と開発に不可欠である。アフィニティクロマトグラフィーは、低分子の標的タンパク質を同定するための古典的な方法として、良好な結果4,5を得た。しかし、この方法には限界があり、その点では、小分子の化学的修飾は、結合特異性または親和性の低下または変化をもたらすことが多い。これらの限界を克服するために、最近、いくつかの新しい戦略が開発され、小分子の化学修飾なしで低分子標的を同定するために適用されています。標識のない低分子の標的同定のためのこれらの直接的な方法には、薬物親和性応答性標的安定性(DARTS)6、酸化速度からのタンパク質の安定性(SPROX)7、細胞熱シフトアッセイ(CETSA)8が含まれる。 、9、および熱プロテオームプロファイリング(TPP)10.これらの方法は、天然の未修飾の低分子を使用し、標的タンパク質11を見つけるために直接結合相互作用のみに依存しているため、非常に有利である。
これらの新しい方法の中で、DARTSは、ほとんどのラボ12、13で簡単に採用することができる比較的簡単な方法論です。DARTSは、リガンド結合タンパク質が非結合タンパク質に対する酵素分解に対する修飾感受性を示す概念に依存する。新しい標的タンパク質は、液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS/MS)を介してSDS-PAGEゲル内の改変バンドを調べることによって検出することができる。このアプローチは、天然物および医薬品の未知の標的の同定に成功した 14,15,16,17,18,19.特定のタンパク質20、21への化合物の結合をスクリーニングまたは検証する手段としても強力である。本研究では,低分子によるタンパク質安定性の変化をモニタリングし,タンパク質リガンド結合親和性を同定することによって実験の改善を提示する.mTOR-ラパマイシン相互作用を例にして、我々のアプローチを実証する。
Protocol
Representative Results
Discussion
DARTSは、分解に対するタンパク質結合の保護効果を利用することにより、低分子標的の同定を可能にします。DARTSは、小分子26の化学修飾または固定化を必要としない。これにより、小分子を使用してタンパク質標的を直接結合させることができます。古典的なDARTS法の標準評価基準には、ゲル染色、質量分析およびウェスタンブロッティング12、13が含まれる。<…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、NIH研究助成金R01NS103931、R01AR062207、R01AR061484、およびDOD研究助成金W81XWH-16-1-0482によって部分的に支援されました。
Materials
| 100X Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | Dilute to 20X with ultrapure water |
| 293T cell line | ATCC | CRL-3216 | DMEM medium with 10% FBS |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher | 23225 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Cell scraper | Thermo Fisher | 179693 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solution | Bio-Rad | 1610436 | |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 6.0 | statistical analysis and drawing software |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.52 | image processing and analysis software |
| M-PER Cell Lysis Reagent | Thermo Fisher | 78501 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Corning | R21-040-CV | |
| Pronase | Roche | PRON-RO | 10 mg/ml |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich | S7920 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma-Aldrich | 450243 | |
| Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich | 221368 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | adjust to pH 8.0 |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 |
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