Étude fonctionnelle In Vivo des variantes humaines rares associées à la maladie utilisant la drosophile
Summary
L’objectif de ce protocole est de décrire la conception et la performance d’expériences in vivo dans Drosophila melanogaster pour évaluer les conséquences fonctionnelles des variantes génétiques rares associées aux maladies humaines.
Abstract
Les progrès de la technologie de séquençage ont rendu les ensembles de données à génome entier et à l’exome entier plus accessibles pour le diagnostic clinique et la recherche de pointe en génétique humaine. Bien qu’un certain nombre d’algorithmes in silico aient été développés pour prédire la pathogénicité des variantes identifiées dans ces ensembles de données, les études fonctionnelles sont essentielles pour déterminer comment des variantes génomiques spécifiques affectent la fonction protéique, en particulier pour le mauvais sens Variantes. Dans le Réseau des maladies non diagnostiquées (UDN) et d’autres consortiums de recherche sur les maladies rares, des organismes modèles (MO), y compris Drosophila, C. elegans, le poisson zèbre et les souris sont activement utilisés pour évaluer la fonction de la maladie humaine putative causant des maladies Variantes. Ce protocole décrit une méthode pour l’évaluation fonctionnelle des variantes humaines rares utilisées dans le centre de dépistage des organismes modèles Drosophila Core de l’UDN. Le flux de travail commence par la collecte d’informations humaines et MO à partir de plusieurs bases de données publiques, en utilisant la ressource Web MARRVEL pour évaluer si la variante est susceptible de contribuer à l’état d’un patient ainsi que la conception d’expériences efficaces basées sur disponibles connaissances et ressources. Ensuite, des outils génétiques (p. ex., T2A-GAL4 et UAS-human cDNA lines) sont générés pour évaluer les fonctions des variantes d’intérêt dans Drosophila. Lors du développement de ces réactifs, des essais fonctionnels à deux volets basés sur des expériences de sauvetage et de surexpression peuvent être effectués pour évaluer la fonction de la variante. Dans la branche de sauvetage, les gènes de la mouche endogène sont « humanisés » en remplaçant le gène orthologue Drosophila par des transgènes humains de référence ou de variante. Dans la branche de surexpression, les protéines humaines de référence et de variante sont exogènes entraînées dans une variété de tissus. Dans les deux cas, tout phénotype évolutif (p. ex. létalité, morphologie des yeux, électrophysiologie) peut être utilisé comme lecture, quelle que soit la maladie d’intérêt. Les différences observées entre les alleles de référence et les alleles de variante suggèrent un effet variante-spécifique, et donc la pathogénie probable. Ce protocole permet des évaluations rapides et in vivo des variantes humaines présumées causant des maladies des gènes avec des fonctions connues et inconnues.
Introduction
Les patients atteints de maladies rares subissent souvent un voyage ardu appelé « odyssée diagnostique » pour obtenir un diagnostic précis1. On pense que la plupart des maladies rares ont une forte origine génétique, ce qui rend les analyses génétiques/génomiques des éléments critiques de la prise de contrôle clinique. En plus du séquençage des panneaux génétiques candidats et de l’analyse de la variation des nombres de copies basée sur les microréseaux chromosomiques, les technologies de séquençage du génome entier (WGS) sont devenues des outils de plus en plus précieux au cours de la dernière décennie2, 3. À l’heure actuelle, le taux de diagnostic pour l’identification d’une variante pathogène connue dans WES et WGS est de 25 % (plus élevé dans les cas pédiatriques)4,5. Pour la plupart des cas qui restent non diagnostiqués après le WES/WGS clinique, un problème commun est qu’il y a beaucoup de gènes et de variantes de candidat. Le séquençage de nouvelle génération identifie souvent des variantes nouvelles ou ultra-rares dans de nombreux gènes, et il est difficile d’interpréter si ces variantes contribuent aux phénotypes de la maladie. Par exemple, bien que la plupart des mutations absurdes ou de changement d’image dans les gènes soient considérées comme des allèles de perte de fonction (LOF) en raison de la désintégration non-écrite de la transcription codée, les mutations tronquantes trouvées dans les derniers exons échappent à ce processus et peuvent fonctionner comme alleles bénins ou de gain de fonction (GOF)6.
En outre, prédire les effets d’un allèle de mauvais sens est une tâche intimidante, car il peut entraîner un certain nombre de scénarios génétiques différents comme décrit pour la première fois par Herman Muller dans les années 1930 (c.-à-d., amorphe, hypomorphe, hypermorphe, antimorphe, néomorphe, ou isomorphe)7 . De nombreux programmes et méthodologies silico ont été développés pour prédire la pathogénicité des variantes de mauvais sens basées sur la conservation évolutive, le type de changement d’acide aminé, la position dans un domaine fonctionnel, la fréquence d’allèle dans la population générale, et d’autres paramètres8. Cependant, ces programmes ne sont pas une solution complète pour résoudre le problème complexe de l’interprétation des variantes. Fait intéressant, une étude récente a démontré que cinq algorithmes de prédiction de la pathogène variante largement utilisés (Polyphen9, SIFT10, CADD11, PROVEAN12, Mutation Taster) s’accordent sur la pathogénicité 80 % du temps8 . Notamment, même lorsque tous les algorithmes sont d’accord, ils renvoient une prédiction erronée de la pathogénicité jusqu’à 11% du temps. Ceci mène non seulement à l’interprétation clinique défectueuse mais peut également dissuader des chercheurs de suivre vers le haut de nouvelles variantes en les énumérant faussement comme bénins. Une façon de compléter la limitation actuelle de la modélisation silico est de fournir des données expérimentales qui démontrent l’effet de la fonction de variante in vitro, ex vivo (par exemple, les cellules cultivées, les organoïdes), ou in vivo.
Les études fonctionnelles in vivo des variantes associées aux maladies rares dans MO ont des forces uniques13 et ont été adoptées par de nombreuses initiatives de recherche sur les maladies rares à travers le monde, y compris le Réseau des maladies non diagnostiquées (UDN) aux États-Unis et Rare Diseases Models and Mechanisms (RDMM) Networks in Canada, Japan, Europe, and Australia14. En plus de ces efforts coordonnés visant à intégrer les chercheurs de MO dans le flux de travail du diagnostic des maladies rares et des études mécanistes à l’échelle nationale, un certain nombre d’études individuelles en collaboration entre les chercheurs cliniques et les chercheurs de MO ont mené à la découverte et la caractérisation de nombreux nouveaux gènes et variantes pathogènes82,83,84.
Dans l’UDN, un centre centralisé de dépistage des organismes modèles (MOSC) reçoit des soumissions de gènes et de variantes candidats avec une description de l’état du patient et évalue si la variante est susceptible d’être pathogène à l’aide d’outils informatiques et in vivo Expériences. Dans la phase I (2015-2018) de l’UDN, le MOSC composé d’un drosophila Core [Baylor College of Medicine (BCM)] et Zebrafish Core (University of Oregon) qui a travaillé en collaboration pour évaluer les cas. En utilisant l’analyse informatique et un certain nombre de stratégies expérimentales différentes dans la drosophile et le poisson zèbre, le MOSC a jusqu’à présent contribué au diagnostic de 132 patients, l’identification de 31 nouveaux syndromes55, la découverte de plusieurs nouveaux humains gènes de la maladie (par exemple, EBF315, ATP5F1D16, TBX217, IRF2BPL18, COG419, WDR3720) et l’expansion phénotypique de la maladie connue (p. ex., CACNA1A21,ACOX122).
En plus des projets au sein de l’UDN, les chercheurs du MOSC Drosophila Core ont contribué à de nouvelles découvertes de gènes pathogènes en collaboration avec les Centers for Mendelian Genomics et d’autres initiatives (p. ex. ANKLE223, TM2D3 24, NRD125, OGDHL25, ATAD3A26, ARIH127, MARK328, DNMBP29) en utilisant le même ensemble d’informatique et de génétique stratégies développées pour l’UDN. Compte tenu de l’importance des études de MO sur le diagnostic des maladies rares, le MOSC a été élargi pour inclure un noyau de C. elegans et un deuxième noyau de poisson zèbre (tous deux à l’Université de Washington à St. Louis) pour la phase II (2018-2022) de l’UDN.
Ce manuscrit décrit un protocole d’étude fonctionnel in vivo qui est activement utilisé dans le noyau d’ODN MOSC Drosophila pour déterminer si les variantes de mauvais sens ont des conséquences fonctionnelles sur la protéine d’intérêt à l’aide de mouches transgéniques qui expriment l’homme Protéines. L’objectif de ce protocole est d’aider les chercheurs de MO à travailler en collaboration avec des groupes de recherche clinique afin de fournir des preuves expérimentales qu’une variante candidate d’un gène d’intérêt a des conséquences fonctionnelles, facilitant ainsi le diagnostic clinique. Ce protocole est le plus utile dans un scénario dans lequel un chercheur de Drosophila est approché par un chercheur clinique qui a un patient rare de maladie avec une variante spécifique de candidat dans un gène d’intérêt.
Ce protocole peut être divisé en trois éléments : (1) la collecte d’informations pour évaluer la probabilité que la variante d’intérêt soit responsable du phénotype du patient et la faisabilité d’une étude fonctionnelle dans Drosophila, (2) la collecte d’outils génétiques existants et d’en établir de nouveaux, et (3) d’effectuer des études fonctionnelles in vivo. Le troisième élément peut en outre être subdivisé en deux sous-éléments en fonction de la façon dont la fonction d’une variante d’intérêt peut être évaluée (expérience de sauvetage ou stratégies basées sur la surexpression). Il est important de noter que ce protocole peut être adapté et optimisé à de nombreux scénarios en dehors de la recherche sur les maladies monogéniques rares (p. ex., maladies courantes, interactions gènes-environnement et écrans pharmacologiques/génétiques pour identifier des cibles thérapeutiques). La capacité de déterminer la fonctionnalité et la pathogénicité des variantes profitera non seulement au patient d’intérêt en fournissant un diagnostic moléculaire précis, mais aura également des impacts plus larges sur la recherche scientifique translationnelle et fondamentale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les études expérimentales utilisant le melanogaster de Drosophila fournissent un système d’ascompte robuste pour évaluer les conséquences des variantes humaines maladie-associées. Cela est dû à l’ampleur des connaissances et des divers outils génétiques qui ont été générés par de nombreux chercheurs dans le domaine de la mouche au cours du siècle dernier89. Tout comme tout autre système expérimental, cependant, il est important de reconnaître les mises en garde et les l…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Jose Salazar, Julia Wang et karen Schulze pour la lecture critique du manuscrit. Nous reconnaissons les Drs Ning Liu et Xi Luo pour la caractérisation fonctionnelle des variantes TBX2 discutées ici. Le Centre de dépistage des organismes modèles du Réseau des maladies non diagnostiquées a reçu l’appui du National Institutes of Health (NIH) Common Fund (U54 NS093793). H. T. C. a également reçu l’appui des NIH[CNCDP-K12 et NINDS (1K12 NS098482)], de l’American Academy of Neurology (Neuroscience Research grant), burroughs Wellcome Fund (Career Award for Medical Scientists), Child Neurology Society et Child Neurology Foundation ( PERF Elterman), et le Prix pour l’indépendance anticipée du directeur des NIH (DP5 OD026426). M. F. W. a également reçu le soutien de la Fondation Simons (Prix SFARI : 368479). S. Y. a également reçu le soutien des NIH (R01 DC014932), de la Fondation Simons (Prix SFARI : 368479), de la Alzheimer’s Association (New Investigator Research Grant : 15-364099), du Fonds familial Naman pour la recherche fondamentale et du Fonds de droit Caroline Wiess pour la recherche en Médecine moléculaire. La microscopie confocale au BCM est appuyée en partie par la subvention U54HD083092 des NIH au centre de neurovisualisation du Centre de recherche sur les déficiences intellectuelles et développementales (CRDI).
Materials
| Drosophila Stocks for UAS-human cDNA transgenesis | |||
| Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) | BDSC | #24871 | Specific Reagent: VK33 (3rd chromosome) Injection line |
| Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) | BDSC | #24872 | Specific Reagent: VK37 (2nd chromosome) Injection line |
| Plasmid DNA | |||
| Cloning vector | Thermo Fisher | #12536-017 | Specific Reagent: pDONR221 |
| Drosophila transgenesis vector | Gift from Drs. Johannes Bischof and Konrad Basler (Bischof et al., 2013 PNAS) | Specific Reagent: pGW-HA.attB | |
| Molecular biology kits and reagents | |||
| Agarose | Sigma-Aldrich | #A2790 | Specific Reagent: Agarose (molecular biology grade) |
| Chemically Competent Cells (E. coli) | Thermo Fisher | #18265017 | Specific Reagent: DH5α |
| DNA Gel Extraction kit | Thermo Fisher | #K210012 | Specific Reagent: PureLink Gel Extraction Kit |
| DNA Isolation and purification kit | Qiagen | #27104 | Specific Reagent: QIAprep Spin Miniprep Kit |
| High Fidelity Polymerase | NEB | #M0491 | Specific Reagent: Q5 Polymerase kit |
| Recombinase mediated cloning system | Thermo Fisher | #11789020 | Specific Reagent: Gateway BP Clonase kit |
| Recombinase mediated cloning system | Thermo Fisher | #11791100 | Specific Reagent: Gateway LR Clonase II Enzyme kit |
| Site Directed Mutagenesis kit | Agilent | #200523 | Specific Reagent: Quick Change II Mutagenesis kit |
| Electroretinogram Rig related equipment | |||
| ERG Analysis | Molecular Devices | N/A | Specific Reagent: Axon pCLAMP 10 Data Software Package |
| ERG Data Collection | LabX | #R150358 | Specific Reagent: ISO-DAM Isolated Biologic Amplifier |
| ERG Stimulator | Astro-Med | #S48 | Specific Reagent: Square Pulse Stimulator |
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