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Génétique

In Vivo Funktionelle Studie von krankheitsassoziierten seltenen menschlichen Varianten mit Drosophila

Published: August 20, 2019
doi:
10.3791/59658
, , , ,
1Department of Molecular and Human Genetics,Baylor College of Medicine, 2Program in Developmental Biology,Baylor College of Medicine, 3Department of Pediatrics, Section of Neurology and Developmental Neuroscience,Baylor College of Medicine, 4Jan and Dan Duncan Neurological Research Institute,Texas Children’s Hospital, 5Department of Neuroscience,Baylor College of Medicine

Summary

Ziel dieses Protokolls ist es, das Design und die Leistung von In-vivo-Experimenten in Drosophila melanogaster zu skizzieren, um die funktionellen Folgen seltener Genvarianten im Zusammenhang mit menschlichen Krankheiten zu bewerten.

Abstract

Fortschritte in der Sequenzierungstechnologie haben Vollgenom- und Ganzexom-Datensätze sowohl für die klinische Diagnose als auch für die Spitzenforschung der Humangenetik zugänglicher gemacht. Obwohl eine Reihe von Silico-Algorithmen entwickelt wurden, um die Pathogenität der in diesen Datensätzen identifizierten Varianten vorherzusagen, sind funktionelle Studien entscheidend, um zu bestimmen, wie spezifische genomische Varianten die Proteinfunktion beeinflussen, insbesondere für Missense Varianten. Im Undiagnosed Diseases Network (UDN) und anderen Forschungskonsortien für seltene Krankheiten werden Modellorganismen (MO) einschließlich Drosophila, C. elegans,Zebrafische und Mäuse aktiv verwendet, um die Funktion von vermeintlichen menschlichen Krankheiten zu bewerten. Varianten. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur funktionellen Bewertung seltener menschlicher Varianten, die im Model Organisms Screening Center Drosophila Core des UDN verwendet werden. Der Workflow beginnt mit dem Sammeln von menschlichen und MO-Informationen aus mehreren öffentlichen Datenbanken, wobei die MARRVEL-Webressource verwendet wird, um zu beurteilen, ob die Variante wahrscheinlich zum Zustand eines Patienten beiträgt, sowie effektive Experimente auf der Grundlage verfügbarer Wissen und Ressourcen. Als nächstes werden genetische Werkzeuge (z.B. T2A-GAL4 und UAS-Human cDNA-Linien) generiert, um die Funktionen von Varianten von Interesse an Drosophilazu bewerten. Bei der Entwicklung dieser Reagenzien können zweigleisige funktionelle Assays auf Basis von Rettungs- und Überexpressionsexperimenten durchgeführt werden, um die Variantenfunktion zu bewerten. Im Rettungszweig werden die endogenen Fliegengene “humanisiert”, indem das orthologe Drosophila-Gen durch Referenz- oder Varianten-Humantransgene ersetzt wird. Im Überexpressionszweig werden die Referenz und die Variante menschlicher Proteine exogen in einer Vielzahl von Geweben angetrieben. In beiden Fällen kann jeder verschreibbare Phänotyp (z. B. Letalität, Augenmorphologie, Elektrophysiologie) unabhängig von der Krankheit des Interesses als Auslese verwendet werden. Die beobachteten Unterschiede zwischen Referenz- und Variantenallelen deuten auf einen variantenspezifischen Effekt und damit auf eine wahrscheinliche Pathogenität hin. Dieses Protokoll ermöglicht schnelle, in vivo Bewertungen von vermeintlichen menschlichen krankheitserregenden Varianten von Genen mit bekannten und unbekannten Funktionen.

Introduction

Patienten mit seltenen Krankheiten unterziehen sich oft einer anstrengenden Reise, die als “diagnostische Odyssee” bezeichnet wird, um eine genaue Diagnose zu erhalten1. Es wird angenommen, dass die meisten seltenen Krankheiten einen starken genetischen Ursprung haben, was genetische/genomische Analysen zu kritischen Elementen der klinischen Aufarbeitung macht. Neben der Sequenzierung von Kandidatengenpanels und der Variationsvariation von Kopierzahlen auf Basis von chromosomalen Mikroarrays sind Die Technologien für die Ganz-Exom-Sequenzierung (WES) und die Vollgenomsequenzierung (WGS) in den letztenzehnJahren zu immer wertvolleren Werkzeugen geworden. 3. Derzeit liegt die diagnostische Rate zur Identifizierung einer bekannten pathogenen Variante in WES und WGS bei 25 % (höher in pädiatrischen Fällen)4,5. In den meisten Fällen, die nach dem klinischen WES/WGS nicht diagnostiziert werden, ist ein häufiges Problem, dass es viele Kandidatengene und Varianten gibt. Die Sequenzierung der nächsten Generation identifiziert häufig neuartige oder ultraseltene Varianten in vielen Genen, und es ist eine Herausforderung, zu interpretieren, ob diese Varianten zu Krankheitsphänotypen beitragen. Obwohl beispielsweise die meisten Unsinn- oder Frameshift-Mutationen in Genen als Funktionsverlust -allele (LOF) aufgrund des unsinnig vermittelten Zerfalls des codierten Transkripts angesehen werden, entweichen abgeschnittene Mutationen, die in den letzten Exons gefunden wurden, diesem Prozess und können als gutartige oder Funktionsverstärkung (GOF) Allele6.

Darüber hinaus ist die Vorhersage der Auswirkungen eines Missense-Alleels eine gewaltige Aufgabe, da es zu einer Reihe verschiedener genetischer Szenarien führen kann, wie Sie erstmals von Herman Muller in den 1930er Jahren beschrieben wurden (d. h. amorph, hypomorph, hypermorph, antimorph, neomorph oder isomorph)7 . Zahlreiche Silico-Programme und -Methoden wurden entwickelt, um die Pathogenität von Missense-Varianten auf der Grundlage der evolutionären Konservierung, der Art der Aminosäureänderung, der Position innerhalb eines funktionellen Bereichs, der Allelhäufigkeit in der allgemeinen Bevölkerung vorherzusagen, und andere Parameter8. Diese Programme sind jedoch keine umfassende Lösung, um das komplizierte Problem der Varianteninterpretation zu lösen. Interessanterweise hat eine aktuelle Studie gezeigt, dass fünf breit angelegte Varianten-Pathogenitätsvorhersagealgorithmen (Polyphen9, SIFT10, CADD11, PROVEAN12, Mutation Taster) sich auf Pathogenität von 80% der Zeit einigen 80% der Zeit8 . Bemerkenswert ist, dass selbst wenn alle Algorithmen zustimmen, sie eine falsche Vorhersage der Pathogenität bis zu 11% der Zeit zurückgeben. Dies führt nicht nur zu fehlerhaften klinischen Interpretation, sondern kann auch Forscher davon abhalten, neue Varianten zu verfolgen, indem sie sie fälschlicherweise als gutartig auflisten. Eine Möglichkeit, die aktuelle Beschränkung der Silico-Modellierung zu ergänzen, besteht darin, experimentelle Daten bereitzustellen, die die Wirkung der Variantenfunktion in vitro, ex vivo (z. B. kultivierte Zellen, Organoide) oder in vivo demonstrieren.

In vivo funktionelle Studien zu varianten seltenen Krankheiten in MO haben einzigartige Stärken13 und wurden von vielen Forschungsinitiativen für seltene Krankheiten auf der ganzen Welt übernommen, einschließlich des Undiagnosed Diseases Network (UDN) in den Vereinigten Staaten und Rare Krankheiten Modelle & Mechanismen (RDMM) Netzwerke in Kanada, Japan, Europa und Australien14. Zusätzlich zu diesen koordinierten Bemühungen, MO-Forscher in den Arbeitsablauf von Diagnosen seltener Krankheiten und mechanistischen Studien auf nationaler Ebene zu integrieren, haben eine Reihe individueller kollaborativer Studien zwischen klinischen und MO-Forschern zu der Entdeckung geführt. und Charakterisierung vieler neuer menschenkranker Gene und Varianten82,83,84.

Im UDN erhält ein zentralisiertes Model Organisms Screening Center (MOSC) Einreichungen von Kandidatengenen und Varianten mit einer Beschreibung des Zustands des Patienten und beurteilt, ob die Variante mit Informatikwerkzeugen und in vivo pathogen sein dürfte. Experimente. In Phase I (2015-2018) des UDN bestand das MOSC aus einem Drosophila Core [Baylor College of Medicine (BCM)] und Zebrafish Core (University of Oregon), das gemeinsam an der Beurteilung von Fällen arbeitete. Mit Hilfe der Informatikanalyse und einer Reihe verschiedener experimenteller Strategien in Drosophila und Zebrafischen hat das MOSC bisher zur Diagnose von 132 Patienten beigetragen, die Identifizierung von 31 neuen Syndromen55, Entdeckung mehrerer neuer Krankheitsgene (z.B. EBF315, ATP5F1D16, TBX217, IRF2BPL18, COG419, WDR3720) und phänotypische Ausdehnung bekannter Krankheiten Gene (z. B. CACNA1A21, ACOX122).

Zusätzlich zu den Projekten innerhalb des UDN haben MOSC Drosophila Core-Forscher in Zusammenarbeit mit den Centers for Mendelian Genomics und anderen Initiativen (z.B. ANKLE223, TM2D3) zu neuen Entdeckungen von Krankheitsgenen beigetragen. 24, NRD125, OGDHL25, ATAD3A26, ARIH127, MARK328, DNMBP29) mit dem gleichen Satz von Informatik und Genetik Strategien, die für die UDN entwickelt wurden. Angesichts der Bedeutung von MO-Studien zur Diagnose seltener Krankheiten wurde das MOSC um einen C. elegans Core und einen zweiten Zebrafischkern (beide an der Washington University in St. Louis) für Phase II (2018-2022) des UDN erweitert.

Dieses Manuskript beschreibt ein in vivo funktionelles Studienprotokoll, das aktiv im UDN MOSC Drosophila Core verwendet wird, um festzustellen, ob Missense-Varianten funktionelle Folgen für das Protein von Interesse haben, indem transgene Fliegen, die menschliche Proteine. Das Ziel dieses Protokolls ist es, MO-Forschern zu helfen, mit klinischen Forschungsgruppen zusammenzuarbeiten, um experimentelle Beweise dafür zu liefern, dass eine Kandidatenvariante in einem Gen von Interesse funktionelle Folgen hat, wodurch die klinische Diagnose erleichtert wird. Dieses Protokoll ist am nützlichsten in einem Szenario, in dem ein Drosophila-Forscher von einem klinischen Forscher angesprochen wird, der einen Patienten mit einer seltenen Krankheit mit einer bestimmten Kandidatenvariante in einem Gen von Interesse hat.

Dieses Protokoll kann in drei Elemente unterteilt werden: (1) Sammeln von Informationen, um die Wahrscheinlichkeit zu beurteilen, dass die Variante des Interesses für den Patientenphänotyp verantwortlich ist, und die Durchführbarkeit einer funktionellen Studie in Drosophila, (2) bestehende genetische Instrumente und die Etablierung neuer Instrumente und (3) die Durchführung funktioneller Studien in vivo. Das dritte Element kann weiter in zwei Unterelemente unterteilt werden, je nach der Bewertung der Funktion einer Interessenvariante (Rettungsexperiment oder überexpressionbasierte Strategien). Es ist wichtig zu beachten, dass dieses Protokoll an viele Szenarien außerhalb der Forschung an seltenen monogenen Krankheiten angepasst und optimiert werden kann (z. B. häufige Krankheiten, Gen-Umwelt-Wechselwirkungen und pharmakologische/genetische Screens zur Identifizierung therapeutischer Ziele). Die Fähigkeit, die Funktionalität und Pathogenität von Varianten zu bestimmen, wird nicht nur dem Patienten von Interesse durch eine genaue molekulare Diagnose nützen, sondern auch breitere Auswirkungen auf die translationale und wissenschaftliche Grundlagenforschung haben.

Protocol

1. Sammeln von menschlichen und MO-Informationen zu bewerten: Wahrscheinlichkeit einer Variante von Interesse verantwortlich für Krankheit Phänotypen und Machbarkeit von funktionellen Studien in Drosophila Führen Sie umfangreiche Datenbank- und Literaturrecherchen durch, um festzustellen, ob die spezifischen Gene und Varianten von Interesse gute Kandidaten sind, um den Phänotyp des Patienten von Interesse zu erklären. Sammeln Sie insbesondere die folgenden Informationen. <li…

Representative Results

Funktionelle Studie von de novo Missense Variant in EBF3 Verbunden mit neuroentwicklungsbedingten PhänotypenBei einem 7-jährigen Mann mit neuroentwicklungsbedingten Phänotypen wie Hypotonie, Ataxie, globaler Entwicklungsverzögerung und ausdrucksstarker Sprachstörung, Ärzte und Humangenetiker am National Institutes of Health Undiagnosed Diseases Project (UDP) identifizierte eine de novo missense Variante (p.R163Q) in EBF3 (Early B-Cell Factor 3)15</su…

Discussion

Experimentelle Studien mit Drosophila melanogaster bieten ein robustes Assay-System, um die Folgen von krankheitsassoziierten menschlichen Varianten zu bewerten. Dies ist aufgrund der großen Menge an Wissen und vielfältigen genetischen Werkzeugen, die von vielen Forschern im Fliegenfeld im letzten Jahrhundert89erzeugt wurden. Wie jedes andere experimentelle System ist es jedoch wichtig, die Vorbehalte und Grenzen anzuerkennen, die es gibt.

Vorbehalte …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Jose Salazar, Julia Wang und Dr. Karen Schulze für die kritische Lektüre des Manuskripts. Wir würdigen Drs. Ning Liu und Xi Luo für die funktionale Charakterisierung der hier diskutierten TBX2-Varianten. Das Screening Center für nicht diagnostizierte Krankheiten wurde vom Common Fund (U54 NS093793) des National Institutes of Health (NIH) unterstützt. H. T. C. wurde weiter unterstützt durch die NIH[CNCDP-K12 und NINDS (1K12 NS098482)], American Academy of Neurology (Neuroscience Research grant), Burroughs Wellcome Fund (Career Award for Medical Scientists), Child Neurology Society and Child Neurology Foundation ( PERF Elterman Grant) und den NIH Director es Early Independence Award (DP5 OD026426). M. F. W. wurde von der Simons Foundation (SFARI Award: 368479) unterstützt. S. Y. wurde weiter unterstützt durch das NIH (R01 DC014932), die Simons Foundation (SFARI Award: 368479), die Alzheimer es Association (New Investigator Research Grant: 15-364099), Den Naman Family Fund for Basic Research und Caroline Wiess Law Fund for Research in Molekulare Medizin. Die konfokale Mikroskopie am BCM wird teilweise durch den NIH-Zuschuss U54HD083092 an das Intellectual and Developmental Disabilities Research Center (IDDRC) Neurovisualization Core unterstützt.

Materials

Drosophila Stocks for UAS-human cDNA transgenesis
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) BDSC #24871 Specific Reagent: VK33 (3rd chromosome) Injection line
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) BDSC #24872 Specific Reagent: VK37 (2nd chromosome) Injection line
Plasmid DNA
Cloning vector Thermo Fisher #12536-017 Specific Reagent: pDONR221
Drosophila transgenesis vector Gift from Drs. Johannes Bischof and Konrad Basler (Bischof et al., 2013 PNAS) Specific Reagent: pGW-HA.attB
Molecular biology kits and reagents
Agarose Sigma-Aldrich #A2790 Specific Reagent: Agarose (molecular biology grade)
Chemically Competent Cells (E. coli) Thermo Fisher #18265017 Specific Reagent: DH5α
DNA Gel Extraction kit Thermo Fisher #K210012 Specific Reagent: PureLink Gel Extraction Kit
DNA Isolation and purification kit Qiagen #27104 Specific Reagent: QIAprep Spin Miniprep Kit
High Fidelity Polymerase NEB #M0491 Specific Reagent: Q5 Polymerase kit
Recombinase mediated cloning system Thermo Fisher #11789020 Specific Reagent: Gateway BP Clonase kit
Recombinase mediated cloning system Thermo Fisher #11791100 Specific Reagent: Gateway LR Clonase II Enzyme kit
Site Directed Mutagenesis kit Agilent #200523 Specific Reagent: Quick Change II Mutagenesis kit
Electroretinogram Rig related equipment
ERG Analysis Molecular Devices N/A Specific Reagent: Axon pCLAMP 10 Data Software Package
ERG Data Collection LabX #R150358 Specific Reagent: ISO-DAM Isolated Biologic Amplifier
ERG Stimulator Astro-Med #S48 Specific Reagent: Square Pulse Stimulator
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References

  1. Boycott, K. M., et al. International Cooperation to Enable the Diagnosis of All Rare Genetic Diseases. The American Journal of Human Genetics. 100 (5), 695-705 (2017).
  2. Lupski, J. R., et al. Whole-Genome Sequencing in a Patient with Charcot-Marie-Tooth Neuropathy. New England Journal of Medicine. 362 (13), 1181-1191 (2010).
  3. Boycott, K. M., Vanstone, M. R., Bulman, D. E., MacKenzie, A. E. Rare-disease genetics in the era of next-generation sequencing: discovery to translation. Nature Reviews Genetics. 14 (10), 681-691 (2013).
  4. Yang, Y., et al. Molecular Findings Among Patients Referred for Clinical Whole-Exome Sequencing. JAMA. 312 (18), 1870 (2014).
  5. Lee, H., et al. Clinical Exome Sequencing for Genetic Identification of Rare Mendelian Disorders. JAMA. 312 (18), 1880 (2014).
  6. Coban-Akdemir, Z., et al. Identifying Genes Whose Mutant Transcripts Cause Dominant Disease Traits by Potential Gain-of-Function Alleles. The American Journal of Human Genetics. 103 (2), 171-187 (2018).
  7. Muller, H. J. Further studies on the nature and causes of gene mutations. Proceedings of the Sixth International Congress of Genetics. , 213-255 (1932).
  8. Ghosh, R., Oak, N., Plon, S. E. Evaluation of in silico algorithms for use with ACMG/AMP clinical variant interpretation guidelines. Genome Biology. 18 (1), 225 (2017).
  9. Adzhubei, I. A., et al. A method and server for predicting damaging missense mutations. Nature Methods. 7 (4), 248-249 (2010).
  10. Vaser, R., Adusumalli, S., Leng, S. N., Sikic, M., Ng, P. C. SIFT missense predictions for genomes. Nature Protocols. 11 (1), 1-9 (2016).
  11. Rentzsch, P., Witten, D., Cooper, G. M., Shendure, J. l., Kircher, M. CADD: predicting the deleteriousness of variants throughout the human genome. Nucleic Acids Research. , (2018).
  12. Choi, Y., Sims, G. E., Murphy, S., Miller, J. R., Chan, A. P. Predicting the functional effect of amino acid substitutions and indels. PloS ONE. 7 (10), 46688 (2012).
  13. Wangler, M. F., et al. Model Organisms Facilitate Rare Disease Diagnosis and Therapeutic Research. Génétique. 207 (1), 9-27 (2017).
  14. Oriel, C., Lasko, P. Recent Developments in Using Drosophila as a Model for Human Genetic Disease. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 2041 (2018).
  15. Chao, H. T., et al. A Syndromic Neurodevelopmental Disorder Caused by De Novo Variants in EBF3. American Journal of Human Genetics. 100 (1), 128-137 (2017).
  16. Oláhová, M., et al. Biallelic Mutations in ATP5F1D, which Encodes a Subunit of ATP Synthase, Cause a Metabolic Disorder. American Journal of Human Genetics. 102 (3), 494-504 (2018).
  17. Liu, N., et al. Functional variants in TBX2 are associated with a syndromic cardiovascular and skeletal developmental disorder. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2454-2465 (2018).
  18. Marcogliese, P. C., et al. IRF2BPL Is Associated with Neurological Phenotypes. American Journal of Human Genetics. 103 (2), 245-260 (2018).
  19. Ferreira, C. R., et al. A Recurrent De Novo Heterozygous COG4 Substitution Leads to Saul-Wilson Syndrome, Disrupted Vesicular Trafficking, and Altered Proteoglycan Glycosylation. The American Journal of Human Genetics. 103 (4), 553-567 (2018).
  20. Kanca, O., et al. De novo variants in WDR37 are associated with epilepsy, colobomas and cerebellar hypoplasia. Americal Journal of Human Genetics. , (2019).
  21. Luo, X., et al. Clinically severe CACNA1A alleles affect synaptic function and neurodegeneration differentially. PLOS Genetics. 13 (7), 1006905 (2017).
  22. Chung, H., et al. ACOX1 induces autoimmunity whereas a de novo gain of function variant induces elevated ROS and glial loss in humans and flies. Cell Metabolism. , (2019).
  23. Yamamoto, S., et al. A Drosophila Genetic Resource of Mutants to Study Mechanisms Underlying Human Genetic Diseases. Cell. 159 (1), 200-214 (2014).
  24. Jakobsdottir, J., et al. Rare Functional Variant in TM2D3 is Associated with Late-Onset Alzheimer’s Disease. PLoS Genetics. 12 (10), 1006327 (2016).
  25. Yoon, W. H., et al. Loss of Nardilysin, a Mitochondrial Co-chaperone for α-Ketoglutarate Dehydrogenase, Promotes mTORC1 Activation and Neurodegeneration. Neuron. 93 (1), 115-131 (2017).
  26. Harel, T., et al. Recurrent De Novo and Biallelic Variation of ATAD3A, Encoding a Mitochondrial Membrane Protein, Results in Distinct Neurological Syndromes. American Journal of Human Genetics. 99 (4), 831-845 (2016).
  27. Tan, K. L., et al. Ari-1 Regulates Myonuclear Organization Together with Parkin and Is Associated with Aortic Aneurysms. Developmental Cell. 45 (2), 226-244 (2018).
  28. Ansar, M., et al. Visual impairment and progressive phthisis bulbi caused by recessive pathogenic variant in MARK3. Human Molecular Genetics. 27 (15), 2703-2711 (2018).
  29. Ansar, M., et al. Bi-allelic Loss-of-Function Variants in DNMBP Cause Infantile Cataracts. The American Journal of Human Genetics. 103 (4), 568-578 (2018).
  30. Wang, J., et al. MARRVEL: Integration of Human and Model Organism Genetic Resources to Facilitate Functional Annotation of the Human Genome. The American Journal of Human Genetics. 100 (6), 843-853 (2017).
  31. Wang, J., Liu, Z., Bellen, H., Yamamoto, S. MARRVEL, a web-based tool that integrates human and model organism genomics information. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  32. Mungall, C. J., et al. The Monarch Initiative: an integrative data and analytic platform connecting phenotypes to genotypes across species. Nucleic Acids Research. 45, 712-722 (2017).
  33. Hu, Y., Comjean, A., Mohr, S. E., Perrimon, N., Perrimon, N. Gene2Function: An Integrated Online Resource for Gene Function Discovery. Genes|Genomes|Genetics. 7 (8), 2855-2858 (2017).
  34. Ioannidis, N. M., et al. An Ensemble Method for Predicting the Pathogenicity of Rare Missense Variants. The American Journal of Human Genetics. 99 (4), 877-885 (2016).
  35. Szklarczyk, D., et al. The STRING database in 2017: quality-controlled protein–protein association networks, made broadly accessible. Nucleic Acids Research. 45 (1), 362-368 (2017).
  36. Hu, Y., et al. Molecular Interaction Search Tool (MIST): an integrated resource for mining gene and protein interaction data. Nucleic Acids Research. 46 (1), 567-574 (2018).
  37. Lawson, C. L., et al. EMDataBank unified data resource for 3DEM. Nucleic Acids Research. 44 (1), 396-403 (2016).
  38. Bienert, S., et al. The SWISS-MODEL Repository-new features and functionality. Nucleic Acids Research. 45 (1), 313-319 (2017).
  39. Webb, B., Sali, A. Comparative Protein Structure Modeling Using MODELLER. Current Protocols in Bioinformatics. 54, 1-37 (2016).
  40. Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. E. The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis. Nature Protocols. 10 (6), 845-858 (2015).
  41. Bamshad, M. J., et al. The Centers for Mendelian Genomics: A new large-scale initiative to identify the genes underlying rare Mendelian conditions. American Journal of Medical Genetics Part A. 158 (7), 1523-1525 (2012).
  42. Sobreira, N. L. M., et al. Matchmaker Exchange. Current Protocols in Human Genetics. 95, 1-15 (2017).
  43. Temple, G., et al. The completion of the Mammalian Gene Collection (MGC). Genome Research. 19 (12), 2324-2333 (2009).
  44. Katzen, F. Gateway ®Recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opinion on Drug Discovery. 2 (4), 571-589 (2007).
  45. Venken, K. J. T., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: A BAC Transgenic Platform for Targeted Insertion of Large DNA Fragments in D. melanogaster. Science. 314 (5806), 1747-1751 (2006).
  46. Bischof, J., et al. A versatile platform for creating a comprehensive UAS-ORFeome library in Drosophila. Development. 140 (11), 2434-2442 (2013).
  47. Bischof, J., Sheils, E. M., Björklund, M., Basler, K. Generation of a transgenic ORFeome library in Drosophila. Nature Protocols. 9 (7), 1607-1620 (2014).
  48. Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. Journal of Visualized Experiments. (27), e1135 (2009).
  49. Balana, B., Taylor, N., Slesinger, P. A. Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells. Journal of Visualized Experiments. (44), e2189 (2010).
  50. Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific C31 integrases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (9), 3312-3317 (2007).
  51. Ringrose, L. Transgenesis in Drosophila melanogaster. Methods in Molecular Biology. 561, 3-19 (2009).
  52. Venken, K. J. T., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: A BAC Transgenic Platform for Targeted Insertion of Large DNA Fragments in D. melanogaster. Science. 314 (5806), 1747-1751 (2006).
  53. Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phiC31. Génétique. 166 (4), 1775-1782 (2004).
  54. Greenspan, R. . Fly Pushing: The Thory and Practice of Drosophila Genetics. , (2004).
  55. Ashburner, M., Golic, K., Hawley, R. S. . Drosophila: A Laboratory Handbook. , (2005).
  56. Diao, F., White, B. H. A Novel Approach for Directing Transgene Expression in Drosophila: T2A-Gal4 In-Frame Fusion. Génétique. 190 (3), 1139-1144 (2012).
  57. Diao, F., et al. Plug-and-Play Genetic Access to Drosophila Cell Types using Exchangeable Exon Cassettes. Cell Reports. 10 (8), 1410-1421 (2015).
  58. Bellen, H. J., et al. The Drosophila Gene Disruption Project: Progress Using Transposons With Distinctive Site Specificities. Génétique. 188 (3), 731-743 (2011).
  59. Lee, P. -. T., et al. A gene-specific T2A-GAL4 library for Drosophila. eLife. 7, (2018).
  60. Venken, K. J. T., et al. MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes. Nature Methods. 8 (9), 737-743 (2011).
  61. Li-Kroeger, D., et al. An expanded toolkit for gene tagging based on MiMIC and scarless CRISPR tagging in Drosophila. eLife. 7, (2018).
  62. Salazar, J. L., Yamamoto, S. Integration of Drosophila and Human Genetics to Understand Notch Signaling Related Diseases. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1066, 141-185 (2018).
  63. Wangler, M. F., Yamamoto, S., Bellen, H. J. Fruit Flies in Biomedical Research. Génétique. 199 (3), 639-653 (2015).
  64. Duffy, J. B. GAL4 system indrosophila: A fly geneticist’s swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
  65. Nagarkar-Jaiswal, S., et al. A library of MiMICs allows tagging of genes and reversible, spatial and temporal knockdown of proteins in Drosophila. eLife. 4, (2015).
  66. Dolph, P., Nair, A., Raghu, P. . Electroretinogram Recordings of Drosophila. (1), (2011).
  67. Lauwers, E., Verstreken, P. Assaying Mutants of Clathrin-Mediated Endocytosis in the Fly Eye. Methods in Molecular Biology. 1847, 109-119 (2018).
  68. Rhodes-Mordov, E., Samra, H., Minke, B. Electroretinogram (ERG) Recordings from Drosophila. Bio-Protocol. 5 (21), (2015).
  69. Deal, S., Yamamoto, S. Unraveling novel mechanisms of neurodegeneration through a large-scale forward genetic screen in Drosophila. Frontiers in Genetics. , (2019).
  70. Chouhan, A. K., et al. Uncoupling neuronal death and dysfunction in Drosophila models of neurodegenerative disease. Acta Neuropathologica Communications. 4 (1), 62 (2016).
  71. Lek, M., et al. Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans. Nature. 536 (7616), 285-291 (2016).
  72. Liberg, D., Sigvardsson, M., Akerblad, P. The EBF/Olf/Collier family of transcription factors: regulators of differentiation in cells originating from all three embryonal germ layers. Molecular and Cellular Biology. 22 (24), 8389-8397 (2002).
  73. Prasad, B. C., et al. Unc-3, a gene required for axonal guidance in Caenorhabditis elegans, encodes a member of the O/E family of transcription factors. Development. 125 (8), 1561-1568 (1998).
  74. Jinushi-Nakao, S., et al. Knot/Collier and Cut Control Different Aspects of Dendrite Cytoskeleton and Synergize to Define Final Arbor Shape. Neuron. 56 (6), 963-978 (2007).
  75. Pozzoli, O., Bosetti, A., Croci, L., Consalez, G. G., Vetter, M. L. Xebf3 is a regulator of neuronal differentiation during primary neurogenesis in Xenopus. Biologie du développement. 233 (2), 495-512 (2001).
  76. Wang, S. S., Lewcock, J. W., Feinstein, P., Mombaerts, P., Reed, R. R. Genetic disruptions of O/E2 and O/E3 genes reveal involvement in olfactory receptor neuron projection. Development. 131 (6), 1377-1388 (2004).
  77. Fulp, C. T., et al. Identification of Arx transcriptional targets in the developing basal forebrain. Human Molecular Genetics. 17 (23), 3740-3760 (2008).
  78. Gécz, J., Cloosterman, D., Partington, M. ARX: a gene for all seasons. Current Opinion in Genetics & Development. 16 (3), 308-316 (2006).
  79. Dubois, L., Vincent, A. The COE–Collier/Olf1/EBF–transcription factors: structural conservation and diversity of developmental functions. Mechanisms of Development. 108 (1-2), 3-12 (2001).
  80. Cook, R. K., et al. The generation of chromosomal deletions to provide extensive coverage and subdivision of the Drosophila melanogaster genome. Genome Biology. 13 (3), 21 (2012).
  81. Chao, H. -. T., et al. A Syndromic Neurodevelopmental Disorder Caused by De Novo Variants in EBF3. The American Journal of Human Genetics. 100 (1), 128-137 (2017).
  82. Sleven, H., et al. De Novo Mutations in EBF3 Cause a Neurodevelopmental Syndrome. The American Journal of Human Genetics. 100 (1), 138-150 (2017).
  83. Harms, F. L., et al. Mutations in EBF3 Disturb Transcriptional Profiles and Cause Intellectual Disability, Ataxia, and Facial Dysmorphism. The American Journal of Human Genetics. 100 (1), 117-127 (2017).
  84. Tanaka, A. J., et al. De novo variants in EBF3 are associated with hypotonia, developmental delay, intellectual disability, and autism. Molecular Case Studies. 3 (6), 002097 (2017).
  85. Blackburn, P. R., et al. Novel de novo variant in EBF3 is likely to impact DNA binding in a patient with a neurodevelopmental disorder and expanded phenotypes: patient report, in silico functional assessment, and review of published cases. Molecular Case Studies. 3 (3), 001743 (2017).
  86. Lopes, F., Soares, G., Gonçalves-Rocha, M., Pinto-Basto, J., Maciel, P. Whole Gene Deletion of EBF3 Supporting Haploinsufficiency of This Gene as a Mechanism of Neurodevelopmental Disease. Frontiers in Genetics. 8, 143 (2017).
  87. Liu, N., et al. Functional variants in TBX2 are associated with a syndromic cardiovascular and skeletal developmental disorder. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2454-2465 (2018).
  88. Mesbah, K., et al. Identification of a Tbx1/Tbx2/Tbx3 genetic pathway governing pharyngeal and arterial pole morphogenesis. Human Molecular Genetics. 21 (6), 1217-1229 (2012).
  89. Bellen, H. J., Yamamoto, S. Morgan’s legacy: fruit flies and the functional annotation of conserved genes. Cell. 163 (1), 12-14 (2015).
  90. Richards, S., et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genetics in Medicine. 17 (5), 405-423 (2015).
  91. McGary, K. L., Park, T. J., Woods, J. O., Cha, H. J., Wallingford, J. B., Marcotte, E. M. Systematic discovery of nonobvious human disease models through orthologous phenotypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (14), 6544-6549 (2010).
  92. Yamamoto, S., et al. A Drosophila Genetic Resource of Mutants to Study Mechanisms Underlying Human Genetic Diseases. Cell. 159, 200-214 (2014).
  93. Ausubel, F. M. . Current Protocols in Molecular Biology. , (1989).
  94. Rubin, G., Spradling, A. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218 (4570), 348-353 (1982).
  95. Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. A Quick, Cost-Free Method of Purification of DNA Fragments from Agarose Gel. Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).
  96. Ronaghi, M. DNA Sequencing :A Sequencing Method Based on Real-Time Pyrophosphate. Science. 281 (5375), 363-365 (1998).
  97. Ho, S. N., Hunt, H. D., Horton, R. M., Pullen, J. K., Pease, L. R. Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction. Gene. 77 (1), 51-59 (1989).

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Citer Cet Article
Harnish, J. M., Deal, S. L., Chao, H., Wangler, M. F., Yamamoto, S. In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila. J. Vis. Exp. (150), e59658, doi:10.3791/59658 (2019).
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