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Génétique

रोग से जुड़े दुर्लभ मानव वेरिएंट Drosophila का उपयोग कर के Vivo कार्यात्मक अध्ययन में

Published: August 20, 2019
doi:
10.3791/59658
, , , ,
1Department of Molecular and Human Genetics,Baylor College of Medicine, 2Program in Developmental Biology,Baylor College of Medicine, 3Department of Pediatrics, Section of Neurology and Developmental Neuroscience,Baylor College of Medicine, 4Jan and Dan Duncan Neurological Research Institute,Texas Children’s Hospital, 5Department of Neuroscience,Baylor College of Medicine

Summary

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य मानव रोगों से जुड़े दुर्लभ जीन वेरिएंट के कार्यात्मक परिणामों का आकलन करने के लिए Drosophila melanogaster में विवो प्रयोगों के डिजाइन और प्रदर्शन की रूपरेखा तैयार करना है।

Abstract

अनुक्रमण प्रौद्योगिकी में अग्रिम दोनों नैदानिक निदान और अत्याधुनिक मानव आनुवंशिकी अनुसंधान के लिए पूरे जीनोम और पूरे-exome datasets और अधिक सुलभ बना दिया है। हालांकि silico एल्गोरिदम में की एक संख्या इन डेटासेट में पहचान वेरिएंट के रोगजनन की भविष्यवाणी करने के लिए विकसित किया गया है, कार्यात्मक अध्ययन कैसे विशिष्ट जीनोमिक वेरिएंट प्रोटीन समारोह को प्रभावित करने का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण हैं, विशेष रूप से missense के लिए वेरिएंट. Undiagnosed रोग नेटवर्क (UDN) और अन्य दुर्लभ रोग अनुसंधान व्यंजन में, मॉडल जीवों (एमओ) Drosophilaसहित, सी elegans, ज़ेब्राफ़िश, और चूहों सक्रिय रूप से putative मानव रोग के कारण के कार्य का आकलन करने के लिए उपयोग किया जाता है वेरिएंट. इस प्रोटोकॉल UDN के मॉडल जीव स्क्रीनिंग केंद्र Drosophila कोर में इस्तेमाल दुर्लभ मानव वेरिएंट के कार्यात्मक मूल्यांकन के लिए एक विधि का वर्णन करता है. कार्यप्रवाह कई सार्वजनिक डेटाबेस से मानव और MO जानकारी एकत्र करने के साथ शुरू होता है, MARRVEL वेब संसाधन का उपयोग करने का आकलन करने के लिए कि क्या संस्करण एक रोगी की स्थिति में योगदान के रूप में के रूप में अच्छी तरह से डिजाइन प्रभावी उपलब्ध प्रयोगों के आधार पर होने की संभावना है ज्ञान और संसाधनों. अगले, आनुवंशिक उपकरण (जैसे, T2A-GAL4 और UAS मानव cDNA लाइनों) Drosophilaमें ब्याज के वेरिएंट के कार्यों का आकलन करने के लिए उत्पन्न कर रहे हैं. इन अभिकर्मकों के विकास पर, बचाव और overexpression प्रयोगों के आधार पर दो आयामी कार्यात्मक परख संस्करण समारोह का आकलन करने के लिए किया जा सकता है. बचाव शाखा में, अंतर्जात मक्खी जीन संदर्भ या भिन्न मानव transgenes के साथ orthologous Drosophila जीन की जगह द्वारा “मानवीकृत” कर रहे हैं. अतिअभिव्यक्ति शाखा में, संदर्भ और भिन्न मानव प्रोटीन exogenously ऊतकों की एक किस्म में संचालित कर रहे हैं. दोनों ही मामलों में, किसी भी scorable phenotype (जैसे, घातकता, नेत्र आकृतिविज्ञान, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी) ब्याज की बीमारी के बावजूद, एक पढ़ने के बाहर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. संदर्भ और भिन्न alleles के बीच मनाया अंतर एक संस्करण-विशिष्ट प्रभाव का सुझाव है, और इस प्रकार की संभावना रोगजनकता. इस प्रोटोकॉल तेजी से अनुमति देता है, ज्ञात और अज्ञात कार्यों के साथ जीन के putative मानव रोग पैदा करने वाले वेरिएंट के vivo आकलन में.

Introduction

दुर्लभ रोगों वाले रोगियों को अक्सर एक कठिन यात्रा से गुजरना पड़ता है जिसे सटीक निदान प्राप्त करने के लिए “निदान odyssey” के रूप में जाना जाताहै 1. अधिकांश दुर्लभ रोगों के लिए एक मजबूत आनुवंशिक मूल है माना जाता है, आनुवंशिक / उम्मीदवार जीन पैनल अनुक्रमण और प्रतिलिपि संख्या भिन्नता विश्लेषण गुणसूत्र microarrays के आधार पर के अलावा, पूरे-exome (WES) और पूरे जीनोम अनुक्रमण (WGS) प्रौद्योगिकियों पिछले एक दशक में तेजी से मूल्यवान उपकरण बन गए हैं2, 3. वर्तमान में, WES और WGS में एक ज्ञात रोगजनक संस्करण की पहचान करने के लिए नैदानिक दर $ 25% (बाल रोग मामलों में उच्च)4,5है। ज्यादातर मामलों के लिए है कि नैदानिक WES/WGS के बाद undiagnosed रहते हैं, एक आम मुद्दा यह है कि वहाँ कई उम्मीदवार जीन और वेरिएंट हैं. अगली पीढ़ी अनुक्रमण अक्सर कई जीनों में उपन्यास या अल्ट्रा दुर्लभ वेरिएंट की पहचान करता है, और व्याख्या है कि क्या इन वेरिएंट रोग phenotypes के लिए योगदान चुनौतीपूर्ण है. उदाहरण के लिए, हालांकि जीन में सबसे बकवास या frameshift उत्परिवर्तनों को नुकसान के समारोह (LOF) encoded प्रतिलिपि की बकवास मध्यस्थता क्षय के कारण alleles माना जाता है, पिछले exons में पाया उत्परिवर्तनों को काटना इस प्रक्रिया से बच और के रूप में कार्य कर सकते हैं सौम्ययाे या लाभ-कार्य (जीओएफ) एलेलेज6|

इसके अलावा, एक missense allele के प्रभाव की भविष्यवाणी एक चुनौतीपूर्ण काम है, क्योंकि यह विभिन्न आनुवंशिक परिदृश्यों की एक संख्या में परिणाम के रूप में पहली बार 1930 के दशक में हरमन Muller द्वारा वर्णित कर सकते हैं (यानी, अरूप, hypomorph, hypermorph, antimorph, neomorph, या isomorph)7 . सिलिको कार्यक्रमों और तरीकों में कई विकासवादी संरक्षण के आधार पर missense वेरिएंट के रोगजनन की भविष्यवाणी करने के लिए विकसित किया गया है, एमिनो एसिड परिवर्तन के प्रकार, एक कार्यात्मक डोमेन के भीतर स्थिति, सामान्य आबादी में एलीले आवृत्ति, और अन्य पैरामीटर8. हालांकि, इन कार्यक्रमों संस्करण व्याख्या की जटिल समस्या को हल करने के लिए एक व्यापक समाधान नहीं हैं. दिलचस्प है, हाल ही में एक अध्ययन से पता चला है कि पांच मोटे तौर पर इस्तेमाल किया संस्करण रोगजनकता भविष्यवाणी एल्गोरिदम (पॉलीफेन9, SIFT10, CADD11, PROVEAN12, उत्परिवर्तन टोस्टर) रोगजनकता पर सहमत हैं 80% समय का . विशेष रूप से, यहां तक कि जब सभी एल्गोरिदम सहमत हैं, वे समय के 11% तक रोगजनकता की एक गलत भविष्यवाणी वापस. यह न केवल दोषपूर्ण नैदानिक व्याख्या की ओर जाता है, लेकिन यह भी उन्हें सौम्य के रूप में झूठी लिस्टिंग द्वारा नए वेरिएंट पर निम्नलिखित से शोधकर्ताओं को रोक सकता है. silico मॉडलिंग में की वर्तमान सीमा के पूरक के लिए एक तरीका है प्रयोगात्मक डेटा है कि इन विट्रो, पूर्व विवो (उदा., सुसंस्कृत कोशिकाओं, organoids), या vivo में संस्करण समारोह के प्रभाव को दर्शाता है प्रदान करने के लिए है.

एमओ में दुर्लभ रोग जुड़े वेरिएंट के vivo कार्यात्मक अध्ययन में अद्वितीय ताकतहै 13 और दुनिया भर में कई दुर्लभ रोग अनुसंधान पहल द्वारा अपनाया गया है, संयुक्त राज्य अमेरिका और दुर्लभ में Undiagnosed रोग नेटवर्क (UDN) सहित रोग मॉडल और तंत्र (RDMM) कनाडा, जापान, यूरोप, और ऑस्ट्रेलिया में नेटवर्क14| एक राष्ट्रीय स्तर पर दुर्लभ रोग निदान और मशीनी अध्ययन के कार्यप्रवाह में एमओ शोधकर्ताओं को एकीकृत करने के लिए इन समन्वित प्रयासों के अलावा, नैदानिक और एमओ शोधकर्ताओं के बीच व्यक्तिगत सहयोगी अध्ययन के एक नंबर की खोज करने के लिए नेतृत्व किया है और कई नए मानव रोग पैदा करने वाले जीनों और रूपों की विशेषता82,83,84.

UDN में, एक केंद्रीकृत मॉडल जीव स्क्रीनिंग सेंटर (MOSC) रोगी की स्थिति का विवरण के साथ उम्मीदवार जीन और वेरिएंट के प्रस्तुतियाँ प्राप्त करता है और यह आकलन करता है कि क्या संस्करण सूचना विज्ञान उपकरणों और विवो का उपयोग करके रोगजनक होने की संभावना है प्रयोगों. UDN के चरण I (2015-2018) में, MOSC में एक Drosophila कोर [बिल्लर कॉलेज ऑफ मेडिसिन (बीसीएम)] और ज़ेब्राफ़िश कोर (ओरेगॉन विश्वविद्यालय) शामिल थे, जिसने मामलों का आकलन करने के लिए सहयोगात्मक रूप से काम किया। सूचना विज्ञान विश्लेषण और Drosophila और ज़ेब्राफ़िश में विभिन्न प्रयोगात्मक रणनीतियों के एक नंबर का उपयोग करना, MOSC अब तक 132 रोगियों के निदान के लिए योगदान दिया है, 31 नए सिंड्रोम की पहचान55, कई नए मानव की खोज रोग जीन (उदा., EBF315, ATP5F1D16, TBX217, IRF2BPL18, COG419, WDR3720) और ज्ञात रोग के phenotypic विस्तार जीन (उदा., CACNA1A21,ACOX122) .

UDN के भीतर परियोजनाओं के अलावा, MOSC Drosophila कोर शोधकर्ताओं ने मेंडेलियन जीनोमिक्स और अन्य पहलों के लिए केंद्र के सहयोग से नई रोग जीन खोजों के लिए योगदान दिया है (जैसे, ANKLE223, TM2D3 24, एनआरडी 125, ओगडीएचएल25, अताड3ए26, अरीह127, मार्क328, डीएनएमबीपी29) इन्फोरेटिक और जेनेटिक के एक ही सेट का उपयोग करते हुए UDN के लिए विकसित रणनीतियों. दुर्लभ रोग निदान पर एमओ अध्ययन के महत्व को देखते हुए, MOSC एक सी elegans कोर और दूसरा ज़ेबराफ़िश कोर (दोनों सेंट लुइस में वाशिंगटन विश्वविद्यालय में) द्वितीय चरण के लिए (2018-2022) UDN के लिए शामिल करने के लिए विस्तार किया गया था.

इस पांडुलिपि में एक vivo कार्यात्मक अध्ययन प्रोटोकॉल है कि सक्रिय रूप से UDN MOSC Drosophila कोर में प्रयोग किया जाता है यह निर्धारित करने के लिए अगर missense वेरिएंट ट्रांसजेनिक मक्खियों कि मानव व्यक्त का उपयोग कर ब्याज के प्रोटीन पर कार्यात्मक परिणाम है का वर्णन प्रोटीन. इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य MO शोधकर्ताओं नैदानिक अनुसंधान समूहों के साथ सहयोग से काम करने में मदद करने के लिए प्रयोगात्मक सबूत है कि ब्याज की एक जीन में एक उम्मीदवार संस्करण कार्यात्मक परिणाम है प्रदान करने के लिए है, इस प्रकार नैदानिक निदान की सुविधा. इस प्रोटोकॉल एक परिदृश्य में सबसे अधिक उपयोगी है जिसमें एक Drosophila शोधकर्ता एक नैदानिक अन्वेषक जो ब्याज की एक जीन में एक विशिष्ट उम्मीदवार संस्करण के साथ एक दुर्लभ रोग रोगी है द्वारा संपर्क किया है.

इस प्रोटोकॉल को तीन तत्वों में विभाजित किया जा सकता है: (1) रोगी फीनोटाइप के लिए जिम्मेदार होने वाले ब्याज के संस्करण की संभावना और ड्रोसोफिलामें एक कार्यात्मक अध्ययन की व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए जानकारी एकत्र करना , (2) सभा मौजूदा आनुवंशिक उपकरण और नए लोगों की स्थापना, और (3) विवो में कार्यात्मक अध्ययन प्रदर्शन. तीसरे तत्व को आगे दो उप-तत्वों में विभाजित किया जा सकता है, इस आधार पर कि ब्याज के किसी प्रकार के कार्य का मूल्यांकन कैसे किया जा सकता है (प्रयोग या अतिअभिव्यक्ति-आधारित रणनीतियों को वापस लिया जा सकता है)। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि इस प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया जा सकता है और दुर्लभ मोनोजेनिक रोग अनुसंधान के बाहर कई परिदृश्यों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है (जैसे, सामान्य रोग, जीन-पर्यावरण बातचीत, और चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने के लिए औषधीय/ वेरिएंट की कार्यक्षमता और रोगजनकता निर्धारित करने की क्षमता न केवल सटीक आणविक निदान प्रदान करके ब्याज के रोगी को लाभ होगा, लेकिन यह भी दोनों translational और बुनियादी वैज्ञानिक अनुसंधान पर व्यापक प्रभाव पड़ेगा.

Protocol

1. मानव और एमओ जानकारी इकट्ठा करने का आकलन करने के लिए: ब्याज की एक भिन्न की संभावना रोग Phenotypes और Drosophila में कार्यात्मक अध्ययन की व्यवहार्यता के लिए जिम्मेदार जा रहा है व्यापक डेटाबेस और साहित्य खो?…

Representative Results

EBF3 में डी नोवो मिससेंस संस्करण के कार्यात्मक अध्ययन neurodevelopmental Phenotypes से जुड़ा हुआhypotonia सहित neurodevelopmental phenotypes के साथ एक 7 साल पुराने पुरुष में, ataxia, वैश्विक विकास में देरी, और अर्थपूर्ण भाषण विकार, चिकित्सको?…

Discussion

Drosophila melanogaster का उपयोग कर प्रयोगात्मक अध्ययन रोग से जुड़े मानव वेरिएंट के परिणामों का आकलन करने के लिए एक मजबूत परख प्रणाली प्रदान करते हैं। यह ज्ञान के विशाल शरीर और विविध आनुवंशिक उपकरणों के कारण है ज?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए जोस Salazar, जूलिया वांग, और डॉ करेन Schulze धन्यवाद. हम यहाँ चर्चा TBX2 वेरिएंट के कार्यात्मक विशेषता के लिए Drs Ning लियू और Xi Luo स्वीकार करते हैं. Undiagnosed रोग नेटवर्क मॉडल जीव स्क्रीनिंग केंद्र स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के माध्यम से समर्थित किया गया था (NIH) आम कोष (U54 NS093793). एच.टी.सी. आगे NIH[CNCDP-K12 और NINDS (1K12 NS098482)], अमेरिकन एकेडमी ऑफ न्यूरोलॉजी (न्यूरोसाइंस रिसर्च ग्रांट), Burroughs वेलकम फंड (चिकित्सा वैज्ञानिकों के लिए कैरियर पुरस्कार), चाइल्ड न्यूरोलॉजी सोसायटी और चाइल्ड न्यूरोलॉजी फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था ( PERF Elterman अनुदान), और NIH निदेशक के प्रारंभिक स्वतंत्रता पुरस्कार (DP5 OD026426). एम एफ डब्ल्यू आगे साइमन्स फाउंडेशन (SFARI पुरस्कार: 368479) द्वारा समर्थित किया गया था। एस वाई आगे NIH द्वारा समर्थित किया गया था (R01 DC014932), साइमन्स फाउंडेशन (SFARI पुरस्कार: 368479), अल्जाइमर एसोसिएशन (नए अन्वेषक अनुसंधान अनुदान: 15-364099), बुनियादी अनुसंधान के लिए नमन परिवार कोष, और कैरोलीन Wies कानून कोष में अनुसंधान के लिए आण्विक चिकित्सा. बीसीएम में Confocal माइक्रोस्कोपी भाग में NIH अनुदान U54HD083092 बौद्धिक और विकासविकलांग अनुसंधान केंद्र (IDDRC) Neurovisualization कोर के लिए समर्थित है.

Materials

Drosophila Stocks for UAS-human cDNA transgenesis
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) BDSC #24871 Specific Reagent: VK33 (3rd chromosome) Injection line
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) BDSC #24872 Specific Reagent: VK37 (2nd chromosome) Injection line
Plasmid DNA
Cloning vector Thermo Fisher #12536-017 Specific Reagent: pDONR221
Drosophila transgenesis vector Gift from Drs. Johannes Bischof and Konrad Basler (Bischof et al., 2013 PNAS) Specific Reagent: pGW-HA.attB
Molecular biology kits and reagents
Agarose Sigma-Aldrich #A2790 Specific Reagent: Agarose (molecular biology grade)
Chemically Competent Cells (E. coli) Thermo Fisher #18265017 Specific Reagent: DH5α
DNA Gel Extraction kit Thermo Fisher #K210012 Specific Reagent: PureLink Gel Extraction Kit
DNA Isolation and purification kit Qiagen #27104 Specific Reagent: QIAprep Spin Miniprep Kit
High Fidelity Polymerase NEB #M0491 Specific Reagent: Q5 Polymerase kit
Recombinase mediated cloning system Thermo Fisher #11789020 Specific Reagent: Gateway BP Clonase kit
Recombinase mediated cloning system Thermo Fisher #11791100 Specific Reagent: Gateway LR Clonase II Enzyme kit
Site Directed Mutagenesis kit Agilent #200523 Specific Reagent: Quick Change II Mutagenesis kit
Electroretinogram Rig related equipment
ERG Analysis Molecular Devices N/A Specific Reagent: Axon pCLAMP 10 Data Software Package
ERG Data Collection LabX #R150358 Specific Reagent: ISO-DAM Isolated Biologic Amplifier
ERG Stimulator Astro-Med #S48 Specific Reagent: Square Pulse Stimulator
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Harnish, J. M., Deal, S. L., Chao, H., Wangler, M. F., Yamamoto, S. In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila. J. Vis. Exp. (150), e59658, doi:10.3791/59658 (2019).
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